郭青云，李坊貞，凌鳳萍，何荔英，易　龍

(贛南師范學(xué)院 a.生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院；b. 研究生部；c. 圖書(shū)館， 江西 贛州 341000)

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中草藥提取液對(duì)柑橘潰瘍病菌體外抑制活性* 1

郭青云a，李坊貞b，?，凌鳳萍a，何荔英c，易龍a

(贛南師范學(xué)院 a.生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院；b. 研究生部；c. 圖書(shū)館， 江西 贛州 341000)

摘要：研究50種中草藥水提取物和乙醇提取物對(duì)柑橘潰瘍病菌的體外抑制活性.結(jié)果表明，山茱萸、訶子、地榆、枳實(shí)、蔓荊子、覆盆子和馬兜鈴7種中草藥水提物和乙醇提取物對(duì)柑橘潰瘍病菌具有明顯抑制活性.其中以訶子提取物抑菌效果最好，水提液和醇提液在藥物濃度5 g/mL時(shí)，抑菌圈直徑可達(dá)3.8 cm和4.4 cm；地榆、枳實(shí)抑菌效果次之.該研究可為開(kāi)發(fā)植物源控制柑橘潰瘍病菌殺菌劑奠定基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：中草藥提取液；柑橘潰瘍病菌；抑菌活性

柑橘潰瘍病是目前柑橘栽培中最具破壞性的一種細(xì)菌性病害，其病原為地毯草黃單胞桿菌柑橘致病變種(Xanthomonasaxonopodispv.citri).此病為害葉片、新梢和未成熟的果實(shí)，引起落葉、枯枝和落果，直接影響當(dāng)年產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì).該病的防治非常困難，是目前國(guó)內(nèi)外檢疫對(duì)象，也是重點(diǎn)防治對(duì)象[1].臍橙對(duì)柑橘潰瘍病特別敏感，其發(fā)病率明顯高于其他柑橘品種，已成為臍橙產(chǎn)區(qū)重要的防病任務(wù)[2].以化學(xué)防治為主導(dǎo)的綜合防治體系難以避免化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品的殘留污染及病原菌抗藥性的產(chǎn)生[3-5].應(yīng)用生物的方法防治柑橘潰瘍病，減少對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的依賴(lài)程度，是柑橘潰瘍病防治領(lǐng)域的重要研究方向.

植物在與有害生物長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中，產(chǎn)生了許多次生代謝產(chǎn)物，大約有40萬(wàn)種，其中的大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)如萜烯類(lèi)、生物堿、類(lèi)黃酮、甾體、酚類(lèi)和獨(dú)特的氨基酸等均具有抗菌或殺蟲(chóng)活性[6-7].我國(guó)幅員遼闊，中草藥資源豐富.據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)具有抑菌成分的中草藥約有5 000余種，近年來(lái)很多研究證實(shí)了中草藥的對(duì)植物病原菌的抑制活性，如訶子、地榆、蔓荊提取液對(duì)楊樹(shù)潰瘍病和小麥赤霉病有很好的抑制作用[8-10].中草藥是天然植物，其安全性較高且不污染環(huán)境、殘留少、選擇性強(qiáng)、不殺傷天敵、病原菌難以產(chǎn)生抗藥性，但是目前還未見(jiàn)中草藥對(duì)柑橘潰瘍病菌抑制活性的相關(guān)報(bào)道，本研究通過(guò)離體抑菌實(shí)驗(yàn)，采用濾紙片法測(cè)定50種中草藥提取液對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑菌活性，篩選具有抑菌作用的植物，為開(kāi)發(fā)高效、低成本的植物源柑橘潰瘍病抑菌劑提供理論依據(jù)，將有助于贛南臍橙產(chǎn)業(yè)的綠色、可持續(xù)發(fā)展.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株和培養(yǎng)基

柑橘潰瘍病菌由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存[2].培養(yǎng)基采用GY培養(yǎng)基：酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，K2HPO410 g，瓊脂粉10 g,水1 000 mL，pH 7.0.

1.1.2植物材料

凹葉厚樸、花椒、紫荊皮、高良姜、牡丹皮、黃芩、沉香、川牛膝、山茱萸、益智仁、五味子、蒼術(shù)、柴胡、石榴皮、訶子、地榆、薤白、艾葉、知母、砂仁、陳皮、穿心蓮、枳實(shí)、蔓荊子、川楝、辛夷、菟絲子、魚(yú)腥草、路路通、覆盆子、馬兜鈴、桔梗、細(xì)辛、連翹、白頭翁、石菖蒲、桑寄生、鉤藤、山萘、丹參、威靈仙、決明子、鎖陽(yáng)、黃柏、金錢(qián)草、澤蘭、穿山龍、小茴香、八角茴香、烏藥均購(gòu)于贛州市黃慶仁棧華氏大藥房.

1.2方法

1.2.1中草藥水提物的制備

分別將50種中草藥100 g粉碎，過(guò)200目篩，用5倍量滅菌去離子水冷浸過(guò)夜，80 ℃浸提4 h，同樣方法提取3次，合并3次提取液減壓濃縮成浸膏狀，用時(shí)經(jīng)濾膜除菌.

1.2.2中草藥醇提物的制備

依照1.2.1中提取方法，將乙醇與滅菌水配比為50%，70%，90%的比例，用5倍體積的量浸泡中草藥粉過(guò)夜，80 ℃浸提4 h，同樣方法提取3次，合并3次提取液減壓濃縮成浸膏狀，盡量揮發(fā)掉乙醇，用時(shí)經(jīng)濾膜除菌.

1.2.350種中草藥提取物對(duì)柑橘潰瘍病菌體外抑制活性測(cè)定

利用瓊脂擴(kuò)散法，將潰瘍病菌稀釋到106cfu/mL，取1 mL稀釋菌液加入到冷卻至40-50 ℃ 25 mL的GY瓊脂培養(yǎng)基中，凝固后用無(wú)菌打孔器在瓊脂培養(yǎng)基上打孔(R=0.5 cm).將中草藥水提取物稀釋成5 g/mL，2.5 g/mL，0.5 g/mL的不同濃度，醇提物稀釋至5 g/mL，取20 ul加入孔中，陰性對(duì)照為GY培養(yǎng)基，然后將平皿置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后取出觀察.用卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，計(jì)算平均值，用抑菌圈直徑表示抑菌活性.

2結(jié)果與分析

2.1中草藥水提液對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑制活性

采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)50種中草藥水提物的抑制柑橘潰瘍病菌活性進(jìn)行了分析，結(jié)果如表1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所測(cè)試的50種中草藥水提液中，僅山茱萸、訶子、地榆、枳實(shí)、蔓荊子、覆盆子和馬兜鈴7種中草藥對(duì)柑橘潰瘍病菌具有抑制活性.各藥物的濃度與抑菌效果成正相關(guān)，藥液濃度越大，抑菌活性越明顯，其中以訶子水提物的抑菌活性最強(qiáng)，在提取液濃度為5 g/mL時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)3.8cm，抑菌活性?xún)?yōu)于現(xiàn)廣泛用于防治柑橘潰瘍病菌的銅制劑[11].抑菌活性順序依次為訶子>枳實(shí)>地榆>覆盆子>蔓荊子>馬兜鈴>山茱萸.

表1　中草藥水提物和乙醇提取物(5 g/mL)對(duì)柑橘潰瘍病的抑菌圈直徑(cm)

“-”代表未觀察到抑菌現(xiàn)象，抑菌圈直徑以cm表示.

2.2中草藥醇提液對(duì)柑橘潰瘍病菌的抑制活性

我們分別用50%，70%，90%的乙醇對(duì)50種中草藥進(jìn)行浸提，以5 g/mL的醇提物濃度進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所測(cè)試的50種中草藥中，僅山茱萸、訶子、地榆、枳實(shí)、蔓荊子、牡丹皮、覆盆子和馬兜鈴8種中草藥醇提液對(duì)柑橘瘍病菌具有抑制活性.乙醇提取的濃度對(duì)提取物的抑菌活性影響很大，訶子、枳實(shí)以50%乙醇提取，地榆、蔓荊子和馬兜鈴以70%的乙醇提取抑菌效果最好，優(yōu)于水提物的抑菌活性，而牡丹皮水提物未見(jiàn)抑菌活性而醇提物具有抑菌活性，可能是該抑菌成分較易溶解于乙醇中，覆盆子醇提物抑菌效果較差，在乙醇濃度達(dá)到90%時(shí)未見(jiàn)抑菌活性.其中訶子的50%乙醇提取物抑菌活性最好，抑菌圈直徑可達(dá)4.4 cm.最大抑菌活性順序依次為訶子>地榆>蔓荊子>枳實(shí)>馬兜鈴>山茱萸>覆盆子>牡丹皮.

3討論

柑橘潰瘍病的防治以化學(xué)方法為主，如常見(jiàn)的有77%可殺得或77%多寧可濕性粉劑600倍液，47%加瑞農(nóng)可濕性粉劑1 000倍液，20%葉青雙可濕性粉劑500倍液，0.5%波爾多液、47%加瑞農(nóng)800倍液，新植霉素3 000倍液，72%農(nóng)用霉素400倍液，20%加收米或20%噻菌銅500倍液等[3-4].銅制劑由于防效好、兼治真菌性病害的優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于柑橘潰瘍病的防治，但研究發(fā)現(xiàn)銅制劑在使用時(shí)易造成藥害、誘發(fā)紅蜘蛛且安全間隔期長(zhǎng)，應(yīng)限制使用[3-4,11].隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量頻繁使用，柑橘潰瘍病對(duì)很多藥劑產(chǎn)生了抗性，失去了初用時(shí)的良好效果，導(dǎo)致柑橘潰瘍病的發(fā)生有逐年加重的趨勢(shì).因此，迫切需要篩選新型防治藥劑特別是綠色環(huán)保的生物藥劑來(lái)解決柑橘潰瘍病菌抗藥性產(chǎn)生問(wèn)題.近年來(lái)人們對(duì)植物抗菌活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性進(jìn)行了大量的深人研究，并以此為模板成功地開(kāi)發(fā)了一些高效農(nóng)藥，如在我國(guó)已利用除蟲(chóng)菊成功開(kāi)發(fā)出高效擬殺蟲(chóng)菊酯[6].本研究選取50種中草藥水提液和乙醇提取液對(duì)柑橘潰瘍病菌進(jìn)行體外抑菌活性試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山茱萸、訶子、地榆、枳實(shí)、蔓荊子、覆盆子和馬兜鈴7種中草藥水提液和醇提液有明顯的抑菌活性，牡丹皮僅醇提液有抑菌活性.抑菌活性最好的中草藥為訶子，水提液和醇提液在藥物濃度5 g/mL時(shí)，抑菌圈直徑可達(dá)3.8 cm和4.4 cm，優(yōu)于孫惠敏等報(bào)道中大部分常用的殺菌劑[11]，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)潛力.植物活性物質(zhì)的提取方法和提取溶劑對(duì)抑菌活性影響很大，我們研究發(fā)現(xiàn)中草藥乙醇浸提液的抑菌活性明顯優(yōu)于水提液，這可能是中草藥的一些成分不能溶于水，而易溶于有機(jī)溶劑中所致.本研究?jī)H以中草藥的水提液和醇提液粗提物為材料進(jìn)行研究，為篩選有抑制柑橘瘍病菌的植物提供了依據(jù)，但對(duì)抑菌活性成分的分離純化及其對(duì)柑橘潰瘍病菌的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究、探討.

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* 收稿日期：2016-01-10

DOI：10.13698/j.cnki.cn36-1037/c.2016.03.016

基金項(xiàng)目：江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(GJJ151010)；贛南師范學(xué)院招標(biāo)課題(15zb09)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目(201003067-02)

作者簡(jiǎn)介：郭青云，女，贛南師范學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院講師、博士，研究方向：微生物學(xué)和生物防治.

通訊作者：?李坊貞，贛南師范學(xué)院研究生處教授，研究方向：植物遺傳學(xué).

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-8332(2016)03-0061-03

Inhibition Activity in Vitro of Chinese Herbs Extracts againstXanthomonasaxonopodispv.citri

GUO Qingyuna, LI Fangzhenb, LING Fengpinga, HE Liyingc, YI Longa

(a.SchoolofLifeandEnvironmentalSciences;b.GraduateSchoolofGannanNormalUniversity;c.Library,GannanNormalUniversity,Ganzhou341000,China)

Abstract:Study on the inhibtory activity of 50 kinds of Chinese herbs water extracts and ethanol extracts against Xanthomonas axonopodis pv. citri from Gannan navel orange. The results showed that 7 kinds of Chinese herbs such as Cornus officinalis Sieb., Terminalia chebula Retz., Sanguisorba officinalis Linn., Citrus aurantium L., Vitex trifolia Linn., Lonicera japonica Thunb, Aristolochia debilis Sieb. et Zucc., had obvious inhibitory activity against Xanthomonas axonopodis pv. Citri. Among them, the antibacterial activity of Terminalia chebula Retz. extracts was the best, with the diameter of inhibition zone of up to 3.8 cm and 4.4 cm under the concentration of 5 g/mL in water extracts and ethanol extracts, respectively, followed by Sanguisorba officinalis Linn. and Citrus aurantium L.. This study will be a base for exploitation the antibacterial plants control of Gannan navel orange canker.

Key words:Chinese herbal extract; Xanthomonas axonopodis pv. citri; antibacterial activity

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/36.1037.C.20160510.1106.008.html