張丙云，裴芳霞，任海偉，馬文鵬（.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050；.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉8300）

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超聲波預(yù)處理對(duì)雙酶法提取酒糟中蛋白質(zhì)的影響

張丙云1，裴芳霞1，任海偉1，馬文鵬2
（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050；2.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉831100）

摘要：為提高酒糟中蛋白質(zhì)的提取率，研究了超聲波預(yù)處理對(duì)雙酶法提取蛋白質(zhì)的影響。以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，篩選適宜酒糟蛋白質(zhì)提取的酶解方案，通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)考察超聲波預(yù)處理對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響并優(yōu)化預(yù)處理參數(shù)。結(jié)果表明，單種酶輔助提取時(shí)，添加纖維素酶的蛋白質(zhì)提取率高于木聚糖酶。與單種酶輔助提取相比，纖維素酶和木聚糖酶2種酶同步添加的雙酶法提取效果最好。雙酶同步提取蛋白質(zhì)的適宜條件為：纖維素酶和木聚糖酶的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是3%和4%，酶提取時(shí)間4.5 h，該條件下蛋白質(zhì)提取率為30.25%。響應(yīng)面優(yōu)化后的超聲波預(yù)處理?xiàng)l件為：料液比1∶17、超聲波時(shí)間38 min和超聲波功率480 W，超聲波預(yù)處理后的蛋白質(zhì)提取率升至43.37%。超聲波預(yù)處理能有效提高酒糟蛋白質(zhì)的酶法提取率。

關(guān)鍵詞：酒糟；纖維素酶；木聚糖酶；超聲波預(yù)處理；蛋白質(zhì)提取

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-02-02；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1602.009.html。

中國(guó)是白酒消費(fèi)和生產(chǎn)大國(guó)，每年產(chǎn)生大量的廢棄酒糟，轉(zhuǎn)化利用不足極易造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。目前，酒糟的再利用途徑主要包括生產(chǎn)有機(jī)肥、發(fā)酵飼料、食用菌、燃料棒、活性炭和食醋等［1-2］。本課題組利用生化方法將酒糟轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖后發(fā)酵制備了木糖醇、乙醇和乳酸等［3-5］。另一方面，酒糟中蛋白質(zhì)含量為12%～18%，飼用價(jià)值較高，但釀酒過程添加的稻殼中含有植酸，會(huì)影響動(dòng)物對(duì)酒糟蛋白的消化吸收，而且酒糟中的蛋白質(zhì)被纖維木質(zhì)素類物質(zhì)包裹，不易被釋到細(xì)胞外，難被生物利用，導(dǎo)致飼用品質(zhì)下降［6］。為進(jìn)一步提高酒糟蛋白質(zhì)的飼用價(jià)值，應(yīng)設(shè)法將其提取利用。

目前，常用的蛋白質(zhì)提取法有化學(xué)法（如醇?jí)A法［7-8］、堿法［9］、溶劑法［10］）、生物法（如酶法［11］）和物理輔助提取法（如粉碎、超聲波、微波、球磨等［12］）。其中，化學(xué)法易引起蛋白質(zhì)變性和環(huán)境污染，酶法則多使用水解蛋白酶類，導(dǎo)致蛋白被水解成肽，造成蛋白損失。研究表明，纖維素酶等碳水化合物酶也可以提高蛋白質(zhì)提取率，該方法在米糠蛋白提取中已得到應(yīng)用［13］，但未見在酒糟蛋白提取中應(yīng)用的報(bào)道。同樣，超聲波作為一種物理輔助提取方法也能有效提高蛋白質(zhì)提取得率［14］。

鑒此，以白酒糟為原料，針對(duì)其致密網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和木質(zhì)纖維素含量高等特點(diǎn)，擬采用纖維素酶和木聚糖酶等碳水化合物酶輔助進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，著重比較單種酶、雙酶分步或同步的酶法提取蛋白方案，并考察超聲波預(yù)處理對(duì)蛋白提取率的影響，以期為酒糟蛋白質(zhì)的提取奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

耗材：白酒糟（以干基計(jì)，蛋白質(zhì)含量為12.74%），甘肅金徽酒股份有限公司；纖維素酶（濾紙酶活10萬(wàn)U/g，廠家推薦最適pH4.8，溫度為50℃），寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；木聚糖酶（濾紙酶活5萬(wàn)U/g，廠家推薦最適pH5.0，溫度為50℃），寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；3，5-二硝基水楊酸等試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京國(guó)華電器有限公司；GZX-924MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KH-600DE數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酶法提取酒糟中蛋白質(zhì)的方案篩選

為確定纖維素酶和木聚糖酶的適宜加酶量和酶解時(shí)間，首先進(jìn)行單種酶輔助提取實(shí)驗(yàn)。分別考察酶添加量（1%、2%、3%、4%和5%）和酶提取時(shí)間（纖維素酶：1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h；木聚糖酶：1.5 h、2 h、2.5 h、3 h和3.5 h）對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響，在此基礎(chǔ)上按照表1中酶解順序進(jìn)行雙酶組合提取實(shí)驗(yàn)。

表1　酶添加順序組合方案設(shè)計(jì)

具體方法為：準(zhǔn)確稱取5 g酒糟樣品，以1∶10（w/v）料液比加入pH4.8的檸檬酸緩沖液，依次進(jìn)行單種酶提取和雙酶組合提取實(shí)驗(yàn)，50℃恒溫提取一定時(shí)間，沸水浴滅酶，快速冷卻后以4000 r/min離心10 min，所得上清液定容至50 mL，采用凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度并按公式（1）計(jì)算提取率：

1.2.2超聲波預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

分別選取超聲波時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）、超聲波功率（100 W、200 W、300 W、400 W、500 W、600 W）和料液比（1∶8 g/mL、1∶10 g/mL、1∶12 g/mL、1∶14 g/mL、1∶16 g/mL、1∶18 g/mL）3個(gè)因素進(jìn)行超聲波預(yù)處理，預(yù)處理后的酒糟在1.2.1中確定的適宜酶解條件下提取蛋白質(zhì)，步驟與計(jì)算方法同1.2.1。在單因素結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以蛋白質(zhì)提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行超聲波預(yù)處理參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化，見表2。

表2　因素水平表

2結(jié)果與分析

2.1單種酶輔助提取蛋白質(zhì)的研究篩選

2.1.1酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖1可知，隨著纖維素酶和木聚糖酶添加量的增加，蛋白質(zhì)提取率呈先增加后降低的趨勢(shì)，纖維素酶在添加量3%時(shí)，提取率最高達(dá)28.34%；木聚糖酶在添加量4%時(shí)，提取率達(dá)到最高值26.43%。另一方面，相同酶添加量條件下，添加纖維素酶的蛋白提取率始終高于木聚糖酶，這是因?yàn)榫圃阍现欣w維素含量較多，且木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)最易受到纖維素酶的作用，使得蛋白質(zhì)提取率升高；而半纖維素是木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的粘合劑，被纖維素和木質(zhì)素等組分包埋，只有在木質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)疏松后才能被木聚糖酶作用。故添加纖維素酶的提取率高于木聚糖酶［15］。纖維素酶的添加量確定為3%，木聚糖酶的添加量確定為4%。

圖1　　加酶量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.2酶提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，纖維素酶作用2.5 h時(shí)的蛋白質(zhì)提取率最高，為25.16%，而木聚糖酶在提取2 h后達(dá)到最高值25.80%?？梢?，適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間有利于蛋白質(zhì)提取。因?yàn)榉磻?yīng)初始階段的底物濃度較高，酶與底物接觸較充分，酶作用時(shí)間越長(zhǎng)，木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)越松散，蛋白質(zhì)越易溶出。但時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)因木質(zhì)素組分對(duì)纖維素酶和木聚糖酶產(chǎn)生的吸附作用而導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率下降。因?yàn)榫圃愕哪举|(zhì)纖維素底物上有很多孔洞，相當(dāng)數(shù)量的孔洞尺寸與酶分子直徑相近。酶一旦進(jìn)入孔洞，就很難游離到水解液中［16］。故纖維素酶和木聚糖酶的酶解時(shí)間分別確定為2.5 h和2 h。

圖2　　酶提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.2酶添加方案對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可知，與單種酶輔助提取蛋白質(zhì)相比，雙酶分步或同步添加的組合法均能有效提高蛋白質(zhì)提取率，且同步添加纖維素酶和木聚糖酶時(shí)的蛋白質(zhì)提取率最高，達(dá)到30.24%，說明纖維素酶和木聚糖酶協(xié)同作用可將原料中纖維素和木聚糖切成短鏈寡聚糖，有利于切斷多糖基質(zhì)中的連接，釋放出更多的蛋白質(zhì)［17］。故確定纖維素酶和木聚糖酶同步添加為適宜酒糟蛋白質(zhì)提取的酶解方案。

圖3　酶添加方式對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3超聲波預(yù)處理對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3.1超聲波時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

固定超聲波功率300 W，料液比1∶10，研究超聲波時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖4可知，隨著超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，并且超聲波處理40 min時(shí)蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最高值43.95%。因?yàn)槌暡ㄗ饔脮r(shí)能產(chǎn)生熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)等［17］，能加速木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的破壞與瓦解，促進(jìn)蛋白質(zhì)提取。但隨著超聲波時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生的熱量過多易導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性降低，使溶出的蛋白質(zhì)變性或沉淀［18］，故超聲波預(yù)處理時(shí)間設(shè)置為40 min。

圖4　超聲波時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.3.2超聲波功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

固定料液比1∶10，超聲時(shí)間40 min，研究超聲波功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖5可知，隨著超聲波功率的增大，蛋白質(zhì)提取率逐漸增加，但功率高于500 W時(shí)增加趨勢(shì)放緩。因?yàn)殡S著超聲波功率的提高，振動(dòng)空化等作用使原料木質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變疏松，有利于酶分子滲透進(jìn)入和蛋白質(zhì)的溶出。當(dāng)功率超過500 W時(shí)，超聲波熱效應(yīng)瞬間增強(qiáng)，容易使蛋白質(zhì)變性，反而不利于其提取溶出［17］，故初步選擇超聲波功率為500 W。

22.3.3料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

圖5　超聲波功率對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

固定超聲波功率300 W，超聲波時(shí)間40 min，研究料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖6可知，隨著料液比的減小，蛋白質(zhì)提取率先上升后下降，當(dāng)料液比為1∶16時(shí)，提取率達(dá)最高值43.31%。因?yàn)楫?dāng)料液比較高時(shí)，體系濃度和黏度值較高，酶解反應(yīng)的傳熱傳質(zhì)進(jìn)程易受高黏度影響；而液體體積的增加可以降低體系黏度，增加傳質(zhì)過程，同時(shí)增大了酶和底物的接觸機(jī)率，有利于蛋白質(zhì)溶出。當(dāng)料液比達(dá)到一定值后會(huì)使溶液濃度過小，超聲波產(chǎn)生的機(jī)械作用不能均勻地作用于底物，使提取率降低［17］，故初步選取料液比為1∶16。

圖6　料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.4響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)2.3中單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)超聲波預(yù)處理參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3　響應(yīng)面法設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)響應(yīng)值（蛋白質(zhì)提取率）進(jìn)行回歸分析，回歸擬合得到蛋白質(zhì)提取率與3個(gè)因素的回歸方程：Y=41.82+0.18*A+0.18*B-0.38*C-0.12*A*B+ 2.5*A*C+0.12*B*C+0.63*A2+0.99*B2+0.15*C2。

回歸方程的方差分析結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明該模型P＜0.001極顯著；失擬項(xiàng)P=0.2813＞0.05，差異不顯著，說明殘差由隨機(jī)誤差引起。方程一次項(xiàng)中A和C（固液比）是極顯著因素，B是顯著因素，方程二次項(xiàng)中A2和B2是顯著因素。AC交互相顯著，表明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)與響應(yīng)值有很大關(guān)系。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，根據(jù)F值大小可知影響因素的主次順序?yàn)槌暡üβ剩玖弦罕龋境暡〞r(shí)間。該模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.971，R2Adj為0.933，因此回歸方程具有相當(dāng)高的擬合度。信噪比S/N為12.636，遠(yuǎn)大于4.0，說明模型的可信度很高，故該模型可用于超聲波預(yù)處理參數(shù)的理論預(yù)測(cè)［19］。

表4　回歸模型方差分析

2.4.1響應(yīng)面分析各因素對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響及優(yōu)化結(jié)果

等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，2個(gè)因素的交互作用越強(qiáng)，等高線越接近橢圓，而圓形則表示交互作用不明顯，并且等高線越密集表明該因素的影響效果越大［20］。由圖7可知，超聲波功率固定在零水平時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨料液比和超聲波時(shí)間的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，并且料液比的響應(yīng)面曲面較超聲波時(shí)間陡，表明料液比較超聲波時(shí)間影響大，二者等高線接近圓形，說明超聲時(shí)間和料液比交互作用不明顯。當(dāng)超聲波時(shí)間固定在零水平時(shí)，隨著超聲波功率的增加，蛋白質(zhì)的提取率呈逐漸增加的趨勢(shì)，而料液比減小使蛋白質(zhì)的提取率先增加后降低。當(dāng)料液比固定在零水平時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)先提高后降低。前期提取率增加的原因是超聲波一旦與體系組分接觸，會(huì)立即產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，原料木質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，從而使蛋白質(zhì)分子的溶出能力增強(qiáng)。而超聲時(shí)間和超聲功率增加到一定值時(shí)，蛋白質(zhì)的某些次級(jí)鍵受到破壞而變性，從而使得蛋白質(zhì)的溶解度下降［21］。

2.4.2最佳預(yù)處理?xiàng)l件的確定及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

經(jīng)Design-Expert 8.0分析，可得超聲波預(yù)處理的最佳條件為：料液比為1∶17.256（w/v）、超聲時(shí)間為38.16 min、超聲功率為485.78 W，該條件下蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)提取率為44.26%。為了驗(yàn)證此模型的可靠性和實(shí)用性，且考慮實(shí)際操作可行性，將上述工藝條件修正為料液比1∶17、超聲波時(shí)間38 min、超聲波功率480 W。該條件下進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3次，得到酒糟蛋白質(zhì)提取率的平均值為43.37%，與預(yù)測(cè)值接近，表明此模型對(duì)優(yōu)化超聲波提取參數(shù)是可行的。

3　結(jié)論

3.1纖維素酶和木聚糖酶的雙酶法同步輔助提取酒糟蛋白質(zhì)的適宜條件為：纖維素酶和木聚糖酶的添加量分別為3%和4%，酶提取時(shí)間4.5 h，該條件下的蛋白質(zhì)提取率為30.25%。

圖7　因素交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)曲面

3.2響應(yīng)面法優(yōu)化后的超聲波預(yù)處理最優(yōu)參數(shù)為：料液比為1∶17、超聲波時(shí)間為38 min、超聲波功率為480 W，經(jīng)超聲波預(yù)處理后，雙酶法輔助提取蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到43.37%。

3.3超聲波預(yù)處理有利于纖維素酶和木聚糖酶同步提取酒糟中的蛋白質(zhì)，具體機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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中圖分類號(hào)：TS262.3；TS261.9；X797

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）05-0099-05

基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（148RJZA015）；新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目青年教師科研培育基金（XJEDU2014S086）。

收稿日期：2015-12-23

作者簡(jiǎn)介：張丙云（1968-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

通訊作者：任海偉（1983-），男，副教授，研究方向?yàn)槭称芳庸じ碑a(chǎn)物綜合利用，E-mail：rhw52571119@163.com。

Effects of Ultrasonic Pretreatment on Protein Extraction from Distillers Grains by Dual-Enzymatic Method

ZHANG Bingyun1，PEI Fangxia1，REN Haiwei1and MAWenpeng2
（1. School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou，Gansu 730050；2. Xinjiang Agricultural Vocational Technical College，Changji，Xinjiang 831100，China）

Abstract：In order to increase the extraction rate of proteins from distillers grains，the effects of ultrasonic pretreatment on protein extraction by dual-enzymatic method were investigated. Protein extraction rate was used as the index to screen out the best enzymatic hydrolysis programs for protein extraction. Besides，ultrasonic pretreatment parameters were optimized by response surface method. The results showed that，protein extraction rate by cellulase-assisted extraction was higher than that by xylanase-assisted extraction，and dual-enzymatic extraction（synchronous addition of both cellulase and xylanase）was superior to single-enzymatic extraction. The optimum dual-enzymatic extraction conditions were summed up as follows：the adding levels of cellulase and xylanase were 3%and 4%respectively，and enzymatic extraction time was 4.5 h. Under these conditions，protein extraction rate was 30.25%. The optimum ultrasonic pretreatment conditions were determined as follows：solid-liquid ratio was 1∶17（g/L），ultrasonic time was 38 min，and ultrasonic power was 480 W. Protein extraction rate increased to 43.37%after ultrasonic pretreatment. In conclusion，ultrasonic pretreatment could effectively increase protein extraction rate.

Key words：distillers grains；cellulose；xylanase；ultrasonic pretreatment；protein extraction