柯潤(rùn)輝，王麗娟，安紅梅，黃新望，尹建軍，宋全厚（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；2.國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100015）

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超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法直接測(cè)定白酒中8種甜味劑

柯潤(rùn)輝1，2，王麗娟1，2，安紅梅1，2，黃新望1，2，尹建軍1，2，宋全厚1，2
（1.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；2.國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100015）

摘要：建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）測(cè)定白酒中8種甜味劑（安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、阿力甜和甜菊糖苷）含量的分析方法。樣品經(jīng)蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，直接進(jìn)入U(xiǎn)PLC-MS/MS中分析檢測(cè)。Waters HSS T3色譜柱為分析柱，甲醇-0.1%乙酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在電噴霧電離源負(fù)離子模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，8種甜味劑在10～500 μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)r＞0.996），方法檢出限在1～3 μg/L之間，基質(zhì)加標(biāo)回收率在89%～106%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤9%，均可達(dá)到白酒中痕量甜味劑的檢測(cè)要求。該方法前處理簡(jiǎn)單，測(cè)定快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，非常適合白酒中多種甜味劑的快速篩查和定量分析。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；白酒；甜味劑

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-02-25；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160225.1725.003.html。

近年來(lái)，隨著消費(fèi)和認(rèn)識(shí)水平的提高，食品的營(yíng)養(yǎng)和健康逐步成為消費(fèi)者關(guān)心的重點(diǎn)。因此，食品中各種添加劑的使用情況越來(lái)越受到人們的關(guān)注。甜味劑是一類(lèi)十分重要的食品添加劑，用以改善食品口感和風(fēng)味，由于其低熱量、高甜度、適合糖尿病人食用等特點(diǎn)而成為蔗糖替代品在食品工業(yè)中廣泛使用。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定了可用于食品加工的甜味劑，包括甜蜜素、安賽蜜、木糖醇、阿力甜等的適用范圍和添加限量［1］。食品添加劑在規(guī)定的劑量范圍內(nèi)使用對(duì)人無(wú)害，若超量使用，則可能引起各種形式的毒性表現(xiàn)，因此，必須對(duì)其使用量進(jìn)行嚴(yán)格管理。

中國(guó)白酒歷史悠久，是中華民族寶貴的文化遺產(chǎn)和特有的傳統(tǒng)產(chǎn)品，深受消費(fèi)者喜歡。為了保護(hù)我國(guó)傳統(tǒng)產(chǎn)品，我國(guó)在食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定白酒不允許添加任何甜味劑［1］。但個(gè)別生產(chǎn)企業(yè)為了降低成本，掩蓋其產(chǎn)品的口感缺陷，仍在生產(chǎn)和勾調(diào)過(guò)程中違規(guī)添加甜味劑，干擾了行業(yè)的健康發(fā)展。近些年來(lái)，國(guó)家有關(guān)部門(mén)在對(duì)全國(guó)白酒的抽檢過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，濫用甜味劑的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。目前，國(guó)標(biāo)檢驗(yàn)方法中一次只能檢測(cè)一種或兩種添加劑［2］，測(cè)定多種成分時(shí)不得不頻繁改變前處理方法和儀器條件，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。隨著食品中甜味劑復(fù)配使用的情況越來(lái)越普遍，為提高工作效率，方便監(jiān)管部門(mén)和生產(chǎn)企業(yè)對(duì)白酒中甜味劑的日常監(jiān)測(cè)，有必要研究對(duì)多種甜味劑同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的方法［3］，這不僅是技術(shù)發(fā)展的需求，也是實(shí)際應(yīng)用的需求。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道白酒中甜味劑的檢測(cè)方法較多，主要有離子色譜法［4］、氣相色譜法［5］、液相色譜法［6-7］、氣相色譜-質(zhì)譜法［8］、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法［9-11］等，檢測(cè)對(duì)象涉及多種甜味劑。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前尚未見(jiàn)到用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法同時(shí)測(cè)定白酒中安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、阿力甜、甜菊糖苷8種常見(jiàn)甜味劑的報(bào)道。由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的高選擇性與高靈敏度，其在甜味劑檢測(cè)中的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣。本實(shí)驗(yàn)建立了超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時(shí)測(cè)定白酒中8種常見(jiàn)甜味劑的方法，簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，為大規(guī)模的白酒監(jiān)督抽查和企業(yè)日常監(jiān)控提供及時(shí)準(zhǔn)確可靠的技術(shù)手段。

1材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

酒樣：市售。

儀器設(shè)備：ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀-ACQUITY TQD電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；ACQUITY UPLC HSS T3（100 m× 2.1 mm×1.8μm）（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q Reference超純水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）；0.22 μm有機(jī)濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

試劑：甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；甲酸、乙酸（HPLC級(jí)，迪馬科技有限公司）；乙酸銨（分析純，迪馬科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。8種甜味劑標(biāo)樣：糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、甜蜜素、甜菊糖苷（純度＞98%，美國(guó)Sigma公司和加拿大TRC公司），阿力甜（純度＞98%，加拿大TRC公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg（精確至0.1 mg）糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、甜蜜素、甜菊糖和阿力甜標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中，用超純水溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。阿斯巴甜在中性水溶液中易分解，配制時(shí)需加入少量乙酸（使溶液pH4.3左右）。將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4℃冰箱中保存，根據(jù)使用需要用流動(dòng)相溶液逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2樣品前處理方法

準(zhǔn)確吸取白酒樣品2.0 mL于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，濾液供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.2.3色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 m×2.1 mm× 1.8μm）；柱溫為40℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為0.1%乙酸水溶液；流速：0.35 mL/min；梯度洗脫程序：0 min，10%A；0～4 min，10%A～90%A；4.0～4.5 min，90%A；4.5～7.0 min，10%A。

1.2.4質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；毛細(xì)管電壓為2.90 kV；離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為400℃，流速為700 L/h；錐孔氣流速為50 L/h。

2結(jié)果與討論

2.1色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了BEH C18柱和BEH HSS T3柱對(duì)8種甜味劑的分離效果，發(fā)現(xiàn)在相同的分離條件下，T3柱的分離效果更好。由于某些被測(cè)物極性較強(qiáng)，流動(dòng)相的洗脫能力不宜過(guò)強(qiáng)，同時(shí)乙腈的毒性較甲醇大；又由于流動(dòng)相進(jìn)入質(zhì)譜儀，添加一定量的緩沖鹽可以增加響應(yīng)值；所以考慮甲醇-水、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-甲酸水溶液3種流動(dòng)相體系。以待測(cè)物質(zhì)在色譜柱上的分離度、峰形、靈敏度等為考察指標(biāo)對(duì)3種流動(dòng)相體系進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，用0.1%乙酸-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)各物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時(shí)間的穩(wěn)定性均優(yōu)于0.1%甲酸-甲醇和5 mmol/L乙酸銨-甲醇。在流動(dòng)相中加入0.1%的乙酸有助于［M+H］+準(zhǔn)分子離子的形成，繼續(xù)增加流動(dòng)相中乙酸的含量，質(zhì)譜響應(yīng)基線噪音增加，靈敏度下降，故實(shí)驗(yàn)選用0.1%乙酸-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

2.1.2質(zhì)譜條件的選擇

離子源為電噴霧電離源（ESI），采用注射泵直接連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行全掃描檢測(cè)，得到一級(jí)質(zhì)譜圖和準(zhǔn)分子離子峰，再用惰性氣體Ar轟擊該母離子，獲得其二級(jí)質(zhì)譜圖及相應(yīng)子離子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8種甜味劑在負(fù)離子模式中響應(yīng)值及靈敏度均高于正離子模式，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇負(fù)離子電離模式。除甜蜜素和甜菊糖苷的母離子裂解時(shí)只得到1個(gè)碎片子離子外（表1），其余6種甜味劑均獲得了豐富的碎片離子。利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式對(duì)選定的定性和定量離子對(duì)進(jìn)行質(zhì)譜毛細(xì)管電壓、碰撞能量、錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使各監(jiān)測(cè)離子豐度和信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)，所得最佳質(zhì)譜條件參數(shù)見(jiàn)表1。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下8種甜味劑的總離子流（TIC）色譜圖見(jiàn)圖1。

表1　　8種甜味劑的質(zhì)譜分析參數(shù)

圖1　　 8種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖（200 μg/L）

2.1.3樣品前處理?xiàng)l件的選擇

由于白酒含有高比例的乙醇，若直接進(jìn)樣分析，乙醇會(huì)影響8種甜味劑在反相C18柱上的保留時(shí)間和峰形，導(dǎo)致保留時(shí)間偏移，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。為了消除乙醇對(duì)檢測(cè)的影響，可采用加水稀釋、氮吹或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法，考慮到氮吹和旋蒸操作相對(duì)復(fù)雜及耗時(shí)，本研究采用加水稀釋的方式。綜合考慮了乙醇濃度、色譜峰形和儀器響應(yīng)值等因素，最終確定稀釋倍數(shù)為5倍。

2.2方法的線性范圍和檢出限

將8種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇∶水（1∶9，v/v）溶液稀釋?zhuān)謩e配制成含量為10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按2.1所確定的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以目標(biāo)組分的峰面積y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)（r）都在0.996以上。用信噪比（S/N）為3確定方法的檢出限（LOD），相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。

2.3精密度和回收率

準(zhǔn)確吸取空白白酒樣品，用微量移液器準(zhǔn)確加入一定量的8種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成100 μg/L濃度水平進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，按1.2節(jié)所述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和測(cè)定，進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，白酒中8種甜味劑的回收率在89%～106%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9%（表3）。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析的要求，可用于白酒中8種甜味劑的同時(shí)檢測(cè)。

表2　　8種甜味劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表3　白酒中8種甜味劑的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4實(shí)際樣品的測(cè)定

按照本文建立的檢測(cè)方法，對(duì)90個(gè)市售白酒樣品進(jìn)行了檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算被測(cè)樣品中各種甜味劑的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)樣品中檢測(cè)出甜蜜素，4個(gè)樣品檢出甜菊糖苷，2個(gè)樣品檢出紐甜，其中有2個(gè)樣品檢出2種甜味劑，其余5種甜味劑未檢出。實(shí)際樣品中各甜味劑檢測(cè)濃度水平范圍為100～1950 μg/L之間。

3　結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀直接測(cè)定白酒中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜和甜菊糖苷8種甜味劑含量的快速測(cè)定和確證方法。應(yīng)用本方法對(duì)白酒中的微量甜味劑進(jìn)行檢測(cè)，前處理步驟簡(jiǎn)單、分離度好、準(zhǔn)確度和靈敏度高，能夠滿足白酒中多種痕量甜味劑殘留的分析要求，與國(guó)標(biāo)方法相比，大大提高了分析效率。本方法的建立為白酒中甜味劑的檢測(cè)提供了可靠而準(zhǔn)確的技術(shù)手段，對(duì)規(guī)范食品添加劑在食品中的使用行為具有重要意義。

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中圖分類(lèi)號(hào)：TS262.3；TS261.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）05-0107-03

收稿日期：2015-11-13

作者簡(jiǎn)介：柯潤(rùn)輝（1980-），博士，高級(jí)工程師，主要研究方向?yàn)槭称钒踩治雠c檢測(cè)技術(shù)，E-mail：runhuike@163.com。

DOI：10.13746/j.njkj.2015418

Simultaneous Determination of Eight Sweeteners in Baijiu by UPLC-MS/MS

KE Runhui1，2，WANG Lijuan1，2，AN Hongmei1，2，HUANG Xinwang1，2，YIN Jianjun1，2and SONG Quanhou1，2
（1. China National Research Institute of Food & Fermentation Industries，Beijing 100015；2. National Food Quality Supervision and Inspection Center，Beijing 100015，China）

Abstract：The method of ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric（UPLC-MS/MS）had been developed for simultaneous determination of eight sweeteners in Baijiu as follows：liquor samples were diluted with distilled water，then filtered through 0.22 μm microporous membrane，and LC separation was performed on a Waters Acquity UPLC system with a HSS T3 column，and 0.1%（v/v）acetic acid-methanol solution were used as mobile phase for gradient elution，after LC separation，MS/MS was adopted for multiple reaction monitoring mode（MRM）. The calibration curves showed good linearity in the range of 10 μg/L to 500 μg/L with the correlation coefficients higher than 0.996. The limits of detection（LODs）were between 1 μg/L and 3 μg/L. The matrix recoveries were within 89%-106%and the relative standard deviations（RSDs）were lower than 9%（n=6）. Such method had the advantages including simple pretreatment，fast and accurate measurement，and high sensitivity，which was suitable for qualitative and quantitative measurement of sweeteners in Baijiu.

Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Baijiu；sweeteners