于春濤，劉　超，孫鳳娥，劉振江（.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州0600；.河北省寧晉縣泥坑酒業(yè)有限責(zé)任公司，河北石家莊054000）

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窖泥變質(zhì)前后細(xì)菌群落差異分析

于春濤1，劉超1，孫鳳娥1，劉振江2
（1.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北滄州061001；2.河北省寧晉縣泥坑酒業(yè)有限責(zé)任公司，河北石家莊054000）

摘要：通過提取窖泥細(xì)菌總DNA，擴(kuò)增16S rDNA構(gòu)建基因文庫，采用高通量測(cè)序的方法，對(duì)窖泥變質(zhì)前后細(xì)菌群落進(jìn)行分析。結(jié)果表明，窖泥變質(zhì)前后細(xì)菌群落存在較大差異，共檢測(cè)出16個(gè)門、174個(gè)種屬。選取優(yōu)勢(shì)種屬進(jìn)行比較，窖泥變質(zhì)前優(yōu)勢(shì)菌屬為：動(dòng)球菌屬（22.63%）、芽孢桿菌屬（12.95%）、紫單胞菌科（12.45%）、芽孢八疊球菌屬（10.60%）等；窖泥變質(zhì)后優(yōu)勢(shì)菌屬為：芽孢八疊球菌屬（61.34%）、嗜冷桿菌屬（10.42%）、未分類菌屬（5.45%）、子單胞菌屬（5.02%）等。本研究初步揭示了窖泥變質(zhì)前后細(xì)菌群落種類和數(shù)量的差異，為窖泥變質(zhì)研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：窖泥；變質(zhì)；細(xì)菌群落；差異分析；高通量測(cè)序

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-04-25；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.0956.001.html。

窖泥在濃香型白酒生產(chǎn)中扮演了極其重要的角色，其中復(fù)雜的菌群與濃香型白酒中復(fù)雜的呈香呈味物質(zhì)的形成直接相關(guān)［1-4］。在釀酒過程中，環(huán)境因素影響窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，菌群結(jié)構(gòu)差異將影響窖泥的老熟或變質(zhì)，從而影響酒的質(zhì)量和風(fēng)格。窖池中窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析和研究對(duì)于了解窖泥質(zhì)量及其酒的香味和風(fēng)格形成發(fā)揮著非常重要的作用，由于大多數(shù)窖泥中細(xì)菌是無法培養(yǎng)的，因此采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法研究窖泥細(xì)菌群落存在很大的局限性［5-8］。

近年來，隨著基于PCR擴(kuò)增技術(shù)的各種微生物免培養(yǎng)方法應(yīng)用于土壤微生物區(qū)系研究，有些學(xué)者嘗試借助于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)研究窖泥微生物群落。如：鄧依等［9］采用16S-23S rRNA ITS-AFLP指紋圖譜分析窖泥原核微生物多樣性，陜小虎等［10］對(duì)利用PCR-DGGE技術(shù)研究窖泥微生物的電泳條件進(jìn)行了優(yōu)化和探討，張文學(xué)等［9］利用16S rDNA克隆文庫技術(shù)研究白酒發(fā)酵糟醅中微生物區(qū)系的構(gòu)成及演變過程。利用高通量測(cè)序技術(shù)分析窖泥變質(zhì)前后的細(xì)菌群落差異的研究相對(duì)較少。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)使用某酒廠提供變質(zhì)前后的兩種窖泥，提取總DNA，經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增構(gòu)建基因文庫，通過高通量測(cè)序得到窖泥中90%以上相關(guān)細(xì)菌信息。

1材料與方法

1.1樣品采集

窖泥樣品取自河北某知名酒廠釀酒車間優(yōu)質(zhì)窖泥（FNK1）和變質(zhì)窖泥（PNK1）。取樣方法是FNK1從窖池的窖壁和窖底各取三點(diǎn)共100 g、PNK1從窖池的窖壁和窖底各取三點(diǎn)共100 g，分裝后密封冷凍保存。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1窖泥預(yù)處理及總DNA提取［11］

稱取0.2 g樣品放入含有0.5 g磁珠的5 mL離心管中，加入1 mL SLX-mLus Buffer，漩渦2 min。經(jīng)OMEGA土壤DNA提取試劑盒，反復(fù)凍融、離心，收集上清液。粗提的窖泥DNA通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化后的窖泥DNA PCR擴(kuò)增效果良好，Qubit2.0檢測(cè)DNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳

PCR擴(kuò)增引物選用已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的16S rDNAV3-V4通用引物，341F引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG，805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC。PCR體系按照如下進(jìn)行：10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mM each）0.5 μL，Genomic DNA 10 ng，Bar-PCR primer F （50 μM）0.5 μL，Primer R（50 μM）0.5 μL，Plantium Taq （5 U/μL）0.5μL，H2O add to 50 μL。配制好的PCR體系按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：94℃變性3 min，做5個(gè)循環(huán)，分別是94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s；再做20個(gè)循環(huán)，分別是94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，然后進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，引入lllumina橋式PCR兼容引物。PCR結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)DNA進(jìn)行回收。

1.2.3 16S rDNA擴(kuò)增片段的測(cè)序、質(zhì)控和聚類

采用Misep測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)得的基因序列經(jīng)質(zhì)量控制軟件Prinsep處理，去除barcode、兩端primer以及部分低質(zhì)量基因序列，經(jīng)質(zhì)控后的基因序列長(zhǎng)度大部分分布在400～600 bp之間，基本滿足分析需要。

對(duì)測(cè)得的基因序列采用uclust軟件進(jìn)行OUT聚類，通常域值的序列相似性定位0.97，操作分類單元被認(rèn)為可能屬于屬。

1.2.4對(duì)處理后序列進(jìn)行物種分類，比較窖泥變質(zhì)前后菌群結(jié)構(gòu)差異

物種分類采用的軟件為RDP classifier，基于OUT聚類的結(jié)果，獲取每一個(gè)OUT聚類的代表序列，分別是長(zhǎng)度最長(zhǎng)序列（length）、豐度最大序列（abundance）和所有序列（ALL）形成3份結(jié)果，并對(duì)各類RDP分析。本文所有的展示，均使用OUT＿ALL中的數(shù)據(jù)，genus水平進(jìn)行展示，采用柱形圖及表格的形式對(duì)比窖泥變質(zhì)前后群落結(jié)構(gòu)差異。

2結(jié)果與分析

2.1窖泥變質(zhì)前后細(xì)菌16SrDNAV3—V4電泳圖譜（圖1）

圖1　　細(xì)菌16S rDNAV3—V4電泳圖譜

結(jié)合圖1中的3條泳道對(duì)比得知，泳道1和泳道2有較清晰地條帶，條帶大小位于400～600 bp之間，DNA提取時(shí)一般都通過試劑盒過柱提取，這種柱子有固定孔徑，從而決定了基因組片段的大小。泳道1比泳道2亮，說明窖泥變質(zhì)后細(xì)菌數(shù)量和豐度均有所提高。

2.2窖泥變質(zhì)前后16S rDNA多樣性分析

擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物去除嵌合體和靶區(qū)域序列，得到的基因序列數(shù)見表1。

表1　處理后基因序列統(tǒng)計(jì)表

將多條序列按其序列間的距離對(duì)它們進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU），通常域值的序列相似性定為0.97，操作分類單元被認(rèn)為屬于屬［21-23］。采用OUT VENN分析圖統(tǒng)計(jì)樣本中共有的和獨(dú)有的OUT數(shù)目，直觀展示出窖泥變質(zhì)前后OUT數(shù)目的差異（圖2）。PNK1有2857個(gè)OTUs，F(xiàn)NK1 有2344個(gè)OTUs，兩者共有553個(gè)OTUs。說明窖泥變質(zhì)后，細(xì)菌的種類和豐度有所提高。

圖2　　窖泥變質(zhì)前后OUT數(shù)

2.3細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)處理后序列，采用RDP classifier軟件對(duì)每條序列在genus水平上計(jì)算其分配到此rank中的概率值，一般概率值大于0.8，即RDP分類域值［24-25］。根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知樣品在屬分類水平的數(shù)據(jù)，樣本中菌群的reads數(shù)目，也就是菌群的豐度值（表2、表3）。

表2　窖泥變質(zhì)前細(xì)菌種類及豐度值

表3　窖泥變質(zhì)后細(xì)菌種類及豐度值

采用柱形圖比較FNK1和PNK1種屬豐度值（圖3）。

圖3　 FNK1和PNK1細(xì)菌種屬豐度值對(duì)比

結(jié)合表2、表3、圖3可知，窖泥變質(zhì)前后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、豐度差異較大，選擇優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行比較。芽孢八疊球菌屬（Sporosarcina）在FNK1和PNK1所占比例為10.60%和61.34%，動(dòng)球菌屬（Planococcaceae incertae sedis）在FNK1和PNK1所占比例為22.63%和0.75%，紫單胞菌科（Proteiniphilum）在FNK1和PNK1所占比例為12.45%和5.02%，芽孢桿菌屬（Bacillus）在FNK1和PNK1所占比例為12.95%和2.40%，類芽孢菌屬（Paenibacillus）在FNK1和PNK1所占比例為8.68%和2.15%，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）在FNK1和PNK1所占比例為0%和10.42%，枝芽孢菌屬（Virgibacillus）在FNK1和PNK1所占比例為8.38%和0.63%，未分類菌屬（unclassified）在FNK1和PNK1所占比例為1.24%和5.45%，產(chǎn)氣莢膜梭菌屬（Clostridium IV）在FNK1和PNK1所占比例為4.09%和0.10%。

3　討論

窖池窖泥發(fā)酵是中國白酒生產(chǎn)工藝的特色之一，對(duì)窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究可為進(jìn)一步正確認(rèn)識(shí)白酒風(fēng)味因子形成機(jī)理、窖泥微生物分布、窖泥變質(zhì)微生物分析有著積極的意義。本研究通過高通量測(cè)序的方法分析濃香型白酒窖池窖泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，重點(diǎn)分析了窖泥變質(zhì)前后細(xì)菌群落差異［12-16］。變質(zhì)后的窖泥出現(xiàn)板結(jié)堅(jiān)硬、白色鹽析、腐臭味的現(xiàn)象，原因是釀酒車間環(huán)境和窖泥營養(yǎng)條件的變化導(dǎo)致微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致物質(zhì)代謝發(fā)生改變，致使窖泥變質(zhì)［17-20］。16S rDNA序列分析表明，窖泥變質(zhì)前后細(xì)菌菌群均比較豐富。窖泥變質(zhì)前優(yōu)勢(shì)菌屬為動(dòng)球菌屬（22.63%）和芽孢八疊球菌屬（10.60%），窖泥變質(zhì)后的細(xì)菌豐度有顯著升高，優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢八疊球菌屬（61.34%）和嗜冷桿菌屬（10.42%）。

芽孢八疊球菌屬為有機(jī)化能營養(yǎng)，產(chǎn)生能量的代謝是嚴(yán)格的呼吸型代謝，氧是最終電子受體，嚴(yán)格需氧。此屬包含2種為人所知的種類：脲芽孢八疊球菌和嗜鹽八疊球菌，后者起于海洋，生長(zhǎng)過程中需要Na+；脲芽孢八疊球菌能有效的把尿素降解為CO2和NH3，這樣使得無緩沖能力的培養(yǎng)基的pH值顯著升高。嗜冷桿菌屬在窖泥變質(zhì)后含量有較大幅度的提升，查閱資料沒有找到其相關(guān)信息。

本研究只分析了窖泥變質(zhì)前后細(xì)菌的群落組成，課題組將繼續(xù)研究窖泥古生菌和真菌群落差異，以期獲得窖泥微生物全貌，為研究窖泥變質(zhì)原因提供參考。

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中圖分類號(hào)：TS261.1；Q93-3；TS262.3；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）05-0061-04

收稿日期：2016-03-17

作者簡(jiǎn)介：于春濤（1979-），男，河北人，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵，E-mail：aimiao818@163.com。

Analysis of the Difference in Bacterial Communities in Pit Mud Before and After the Deterioration

YU Chuntao1，LIU Chao1，SUN Feng'e1and LIU Zhenjiang2
（1.Cangzhou Medical College，Cangzhou，Hebei 061001；2.Ningjin Nikeng Distillery Co. Ltd.，Shijiazhuang，Hebei 054000，China）

Abstract：The bacterial communities in pit mud before and after the deterioration were analyzed by high throughput sequencing DNA technology through the extraction of total bacterial DNA and the construction of gene library by amplification of 16S rDNA. The results showed that，there were significant difference in bacterial communities in pit mud before and after the deterioration，bacteria of 16 phylum and 174 genus in total were detected，the dominant bacteria in pit mud before the deterioration included Planococcaceae（22.63%），Bacillus（12.95%），Proteiniphilum（12.45%），Sporosarcina（10.60%）etc.，and the dominant bacteria in pit mud after the deterioration included Sporosarcina（61.34%），Psychrobacter（10.43%），unclassified bacteria（5.45%），Proteiniphilum（5.02%）etc. This study provided a theoretical base for the research on pit mud deterioration.

Key words：pit mud；deterioration；bacterial community；analysis of the difference；high throughput sequencing