劉芳 楊巖濤 賀福元 劉林 吳雙 王宇紅 蔡光先

摘要：目的 比較補陽還五湯類方（補陽還五湯和腦健片）中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥代動力學特征。方法 將補陽還五湯類方灌胃頸靜脈插管大鼠，采用HPLC-DAD法同時檢測3種成分在不同時間點的血藥濃度，經(jīng)DAS2.0計算得單成分的藥代動力學參數(shù)，再采用總量統(tǒng)計矩（相似度）法整合成整體藥代動力學參數(shù)并進行比較。結(jié)果 3種成分在體內(nèi)的總量統(tǒng)計參數(shù)相差甚遠，而3種成分總和的統(tǒng)計矩參數(shù)卻比較接近，補陽還五湯和腦健片在大鼠體內(nèi)AUC分別為240.6和133.0，MRT分別為3.192 min和3.259 min，VRT分別為21.59 min2和19.75 min2；補陽還五湯和腦健片中3種成分總量的相似度達到0.977 8。結(jié)論 補陽還五湯和腦健片在體內(nèi)代謝過程具有相似性，中藥復方發(fā)揮功效依賴于多成分的整體貢獻。

關(guān)鍵詞：藥代動力學；補陽還五湯；腦健片；阿魏酸；洋川芎內(nèi)酯A；藁本內(nèi)酯

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.021

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0082-05

Comparative Study on Pharmacokinetics of Components of Buyang Huanwu Associated Prescriptions LIU Fang1， YANG Yan-tao1， HE Fu-yuan1， LIU Lin2， WU Shuang1， WANG Yu-hong2， 3， CAI Guang-xian3 （1. Pharmacy School， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， 410007 China； 3. National Key Laboratory Co-built by Departments of Herbal Powder and New Drugs of Hunan Province， Traditional Chinese Medicine Powder Technology and Equipment of National and Local Joint Engineering Laboratory， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To study the pharmacokinetic features of ferulaic acid， senkyunolide A and ligustilide in Buyang Huanwu associated prescriptions （Buyang Huanwu Decoction and Naojian Tablets）. Methods HPLC-DAD was applied for simultaneous determination plasma concentration of three ingredients with jugular venous cannula rats after intragastric administration of Buyang Huanwu associated prescriptions. The pharmacolinetic parameters of each ingredient was calculated by DAS2.0， and then the total quantum statistical moment （TQSM） standard similarity was used to measure the overall pharmacokinetics behaviors. Results There were great differences in the three ingredients after the administration of two prescriptions， while the total quantum statistical parameters were very closely. The TQSM pharmacokinetic parameters of the three components in Buyang Huanwu Decoction and Naojian Tablets showed that AUC， MRT， VRT were 240.6 and 133.0， 3.192 min and 3.259 min， 21.59 min2 and 19.75 min2， respectively. The similarity was up to 0.977 8. Conclusion The metabolic processes in vivo of Buyang Huanwu Decoction and Naojian Tablets have similarities. The efficacy of Chinese herbal compounds mostly depends on the multi-components overall contributions.

Key words： pharmacokinetics； Buyang Huanwu Decoction； Naojian Tablets； ferulaic acid； senkyunolide A； ligustilide

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2012CB723503）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（2014135）；湖南省“十二五”中藥學重點學科（2011年）

通訊作者：賀福元，E-mail：pharmsharking@tom.com；蔡光先，E-mail：366620183@qq.com

補陽還五湯類方包括補陽還五湯及其精簡方（腦健片）。補陽還五湯出自《醫(yī)林改錯·癱痿論》，由黃芪、川芎、當歸等7味中藥組成，系清代醫(yī)家王清任創(chuàng)立的治療半身不遂辨證屬氣虛血瘀證的經(jīng)典名方。腦健片處方是遵循補陽還五湯之方義，秉承“益氣祛瘀生新法”，將補陽還五湯精簡為黃芪、川芎和地龍，經(jīng)過二次開發(fā)而成的新型制劑。本課題組前期研究表明，腦健片治療腦缺血療效顯著[1-2]，現(xiàn)進一步對其代謝動力學進行研究，選擇補陽還五湯類方均含有的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯3種入血成分為檢測指標，研究大鼠灌胃后體內(nèi)藥代動力學參數(shù)變化，旨在探討精簡方配伍變化后其同類成分的藥物動力學變化行為。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

補陽還五湯干浸膏（黃芪120 g，當歸6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，紅花3 g，桃仁3 g，地龍3 g）和腦健片干浸膏（黃芪30 g，川芎9 g，地龍6 g）均由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥所張水寒教授提供，所有藥材質(zhì)量均符合2010年版《中華人民共和國藥典》標準。補陽還五湯按傳統(tǒng)水煎法濃縮干燥后制備成干浸膏，相當于原藥材4.5 g/g。腦健片按新工藝制備，其中川芎以揮發(fā)油量為考察指標，對川芎粗粉進行SFE-CO2萃取，不加夾帶劑，提取1.5 h；地龍以醇浸膏得率及氮含量為指標，溫浸2次，第1次加5倍量50%乙醇溫浸48 h，第2次加4倍量50%乙醇溫浸48 h；再合并藥渣，與黃芪藥粉一同水煎，所有藥液濃縮干燥后即得干浸膏，相當于原藥材4.7 g/g。

阿魏酸對照品（批號MUST-12112204）、洋川芎內(nèi)酯A對照品（批號MUST-12121202）、藁本內(nèi)酯對照品（批號MUST- 12082702），北京盈澤納新化工技術(shù)研究院；乙腈，美國Tedia公司，色譜純；甲醇，美國Tedia公司，色譜純；怡寶純凈水（華潤怡寶飲料有限公司），其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Instech自動采血系統(tǒng)（Instech Solomon公司），離心濃縮儀（Centri Vap，LABCONCO），Agilent-1260型高效液相色譜儀，配有自動進樣器，四元梯度泵，在線真空脫氣機，柱溫箱和二極管陣列檢測器（DAD）；超聲波清洗儀（SB-3200D，寧波新其生物科技股份有限公司），分析天平（JA-3003，上海恒平科學儀器有限公司），Elipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 ?m，安捷倫公司）。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠20只，9～10周齡，體質(zhì)量260～300 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2011-0003。室溫無菌喂養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.4 分組、給藥及處理

建立大鼠實時活體采血方法。將SD大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺上，切開頸下靜脈，分離頸靜脈，埋線，待血液充盈時用眼科剪將頸靜脈剪開一小口，插入特制PU軟管約20 mm深并固定，縫合傷口。灌胃后將插管大鼠與Instech自動采血系統(tǒng)連接。將頸靜脈插管的健康SD大鼠分為補陽還五湯組和腦健片組，每組5只。二方均以4倍于人體劑量的原藥材給藥[3]，折算成干浸膏量分別為12.04 g/kg體質(zhì)量和9.64 g/kg體質(zhì)量。灌胃前采血作為空白血漿，再分別于5、15、30、45、60、90、120、180、240、300、360、480 min采血0.5 mL，并取上層血漿，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 供試品溶液的制備

取藥物血漿100 μL，加0.1 mol/L鹽酸50 μL，混勻后加800 μL乙酸乙酯，渦旋震蕩5 min，8000 r/min離心10 min，取上清液；重復上述操作，合并上清液，離心濃縮儀揮干溶劑后殘渣用50 μL甲醇復溶。

1.6 對照品溶液的制備

分別精密稱量阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對照品，用甲醇溶液制成濃度分別為0.125、0.1、2.5 g/L的標準溶液。其中阿魏酸對照品溶液中含5%乙酸，4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆?，藁本?nèi)酯-20 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 色譜條件

本研究采用HPLC-DAD法與腦健片體外成分測定建立的方法[4]一致。色譜條件：Elipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），柱溫30 ℃；以0.3%乙酸水（A）和乙腈（C）為流動相進行梯度洗脫（0～5 min，15% C；5～30 min，15%～31% C；30～32 min，31%～36% C；32～82 min，36%～72% C；82～90 min，72%～95% C），流速1.0 mL/min；檢測波長為阿魏酸325 nm、洋川芎內(nèi)酯A 280 nm、藁本內(nèi)酯328 nm。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用DAS2.0軟件，分別獲得阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯3種成分的經(jīng)典藥代動力學參數(shù)，參照文獻[5-6]按總量統(tǒng)計矩（相似度）法計算藥代動力學總量統(tǒng)計矩參數(shù)，并進行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性與專屬性考察

分別取空白血漿，加入阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯標準品溶液的空白血漿，補陽還五湯和腦健片給藥后30 min的藥物血漿樣本，處理后上樣分析，見圖1。結(jié)果顯示血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定，該方法專屬性良好。根據(jù)前期研究結(jié)果，由保留時間和紫外光譜圖確定1號峰為阿魏酸，2號峰為洋川芎內(nèi)酯A，3號峰為藁本內(nèi)酯[4]。

2.2 標準曲線的建立及線性關(guān)系考察

取空白血漿100 μL，依次加入“1.6”項下3種對照品各20 μL，處理后上樣分析，采用程序進樣，設(shè)定進樣體積依次為0.05、0.1、0.2、1.0、2.5、5、15、20 μL。記錄各成分最大吸收波長下的峰面積，以進樣的絕對質(zhì)量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果見表1。

2.3 精密度和重復性考察

將“2.2”項下藥物血漿連續(xù)進樣5次，每次10 μL，記錄峰面積值，計算RSD值。結(jié)果所得血漿中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯峰面積RSD分別為0.85%、0.84%、1.79%，表明本法精密度良好。取5份空白血漿100 μL，按“2.2”項下方法平行加入3種對照品溶液，處理后分別進樣10 μL，記錄峰面積值，計算RSD。結(jié)果表明，5份空白血漿中加入3種藥效成分，測得阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯峰面積RSD分別為1.50%、2.91%、3.32%，表明本法用于體內(nèi)藥物血漿測定重復性良好。

2.4 體內(nèi)加樣回收率試驗

按高、中、低3個濃度進行加樣回收率試驗。分別取大鼠空白血漿100 μL，加入一定量的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對照品溶液，配制高、中、低3個不同濃度的樣品，處理后進樣分析，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯A均具有較高的回收率，遠高于生物樣品藥物回收率至少為80%的要求，說明本研究采用離心濃縮儀揮干血漿樣品能有效避免化學成分的丟失，此法明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的吹氮法。其中藁本內(nèi)酯的加樣回收率略有偏高，這可能與藁本內(nèi)酯自身化學結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性相關(guān)。

2.5 藥代動力學測定

將各組血漿樣品預處理后進樣分析，分別計算補陽還五湯和腦健片給藥后阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯在不同時間點的血藥濃度，得各成分量-時曲線，見圖2。采用DAS2.0藥代動力學軟件處理得出3種成分的藥代動力學參數(shù)，見表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿魏酸在補陽還五湯類方灌胃大鼠后藥代動力學行為較相似，Cmax持平，且AUC值也基本相同，但是洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥代動力學特征相差較大。采用總量統(tǒng)計矩法對補陽還五湯類方中3種成分在體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)繼續(xù)深入分析，計算單成分及3種成分總和的統(tǒng)計矩參數(shù)，見表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯類方灌胃大鼠后，3種成分在體內(nèi)的零階矩、一階矩、二階矩參數(shù)均相差較大。但是，3種成分總和的統(tǒng)計矩參數(shù)卻比較接近，特別是總量的一階矩和二階矩參數(shù)非常接近，MRT值分別為3.192 min和3.259 min，VRT值分別為21.59 min2和19.75 min2，提示補陽還五湯類方在體內(nèi)的代謝過程較為相似，體現(xiàn)了中藥復方發(fā)揮功效確實依賴于多成分的整體貢獻。

2.6 補陽還五湯類方單成分及總量兩兩間藥物動力學相似度分析

依據(jù)文獻[7]方法對補陽還五湯類方中單成分及3個總成分的總量統(tǒng)計矩參數(shù)進行相似度分析，見表5。從單成分看，補陽還五湯和腦健片灌胃大鼠后，阿魏酸在體內(nèi)的代謝相似度僅為0.506 9，洋川芎內(nèi)酯A相似度為0.804 1，藁本內(nèi)酯為0.347 8，證實僅對1種成分進行分析不能代表中藥復方多成分在體內(nèi)的整體代謝過程。而對3種成分總量分析則發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯和腦健片在體內(nèi)代謝過程相似度達到0.977 8，說明二方的總體功效相似。

3 討論

中藥發(fā)揮藥效往往取決于多種藥效成分的協(xié)同作用，講究君臣佐使配伍原則。采用傳統(tǒng)西藥藥代動力學模型對中藥復方藥代參數(shù)進行分析，發(fā)現(xiàn)同一藥效成分在不同藥效部位、不同藥材及不同配伍復方中的藥代動力學特征均不盡相同[8-10]。本研究表明，采用房室模型對補陽還五湯類方中單個成分分析，洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯在體內(nèi)藥代動力學特征均存在較大差異，說明處方的精簡較大程度改變洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的代謝過程，這可能是由于補陽還五湯與腦健片處方中其他單味藥的差異引起各有效成分相互作用而產(chǎn)生不同結(jié)果。但是，采用總量統(tǒng)計矩法對補陽還五湯類方中3種成分藥代動力學參數(shù)深入分析，發(fā)現(xiàn)3種成分總和統(tǒng)計矩參數(shù)差異較??；進一步對3種成分總量分析，發(fā)現(xiàn)補陽還五湯和腦健片在體內(nèi)代謝過程的相似度達到0.977 8，體現(xiàn)了中藥復方發(fā)揮功效依賴于多成分的整體貢獻。而我們前期研究結(jié)果表明，補陽還五湯類方均能發(fā)揮抗腦缺血損傷功效[1-2]，且總體功效相當，提示兩方在一定程度上有相似的代謝過程，這是否暗示兩方基本藥效物質(zhì)基礎(chǔ)類似？后續(xù)將展開相關(guān)研究。

采用傳統(tǒng)西藥單一成分藥代動力學模型對中藥多成分在體內(nèi)藥代動力學行為進行評價存在一定的局限性[11]，不能充分體現(xiàn)補陽還五湯類方整體成分在體內(nèi)的真實代謝過程。本研究采用總量統(tǒng)計矩參數(shù)對經(jīng)典房室模型的藥動參數(shù)繼續(xù)深入分析，既能反映總量藥物濃度的動力學行為，又能與單個成分的統(tǒng)計矩參數(shù)關(guān)聯(lián)，是整合多成分藥物動力學較宜的數(shù)學處理方法，同時更能體現(xiàn)出中藥多種化學成分多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)進行整合調(diào)節(jié)的優(yōu)越性。

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（收稿日期：2016-01-08）

（修回日期：2016-01-28；編輯：華強）