鄭　末，　姜忠敏

(天津市第五中心醫(yī)院病理科，天津 300450)

連翹苷對(duì)Lewis肺癌VEGF和內(nèi)皮抑素表達(dá)的影響*

鄭末△，姜忠敏

(天津市第五中心醫(yī)院病理科，天津 300450)

[摘要]目的： 探討連翹苷對(duì)Lewis肺癌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血管生成抑制因子內(nèi)皮抑制素(endostatin)蛋白表達(dá)的影響。方法: 免疫組化染色檢測(cè)臨床收集的正常肺部組織、癌旁組織和肺癌組織樣本中VEGF和endostatin的蛋白表達(dá)。設(shè)空白對(duì)照組10只，同時(shí)于40只小鼠右肢腋窩皮下接種Lewis瘤細(xì)胞，隨機(jī)分為模型組、連翹苷低劑量組、連翹苷中劑量組和連翹苷高劑量組，每組10只。模型組每天1次灌胃等體積無(wú)菌水；連翹苷低、中劑量組每天灌胃5、10 g/kg連翹苷1次；高劑量組每天灌胃10 g/kg連翹苷2次。給藥20 d后取肺部組織進(jìn)行HE染色和免疫組化染色檢測(cè)腫瘤組織形態(tài)學(xué)與肺部組織中VEGF和endostatin的蛋白表達(dá)。 結(jié)果: 臨床樣本中，與正常組織和癌旁組織相比，肺癌組織中的VEGF呈高表達(dá)，endostatin呈低表達(dá)。連翹苷隨劑量增加可顯著減少Lewis肺癌小鼠腫瘤體積和瘤組織密度；給予不同劑量連翹苷后，VEGF在肺癌組織中表達(dá)顯著低于模型對(duì)照組，而endostatin表達(dá)則明顯高于模型對(duì)照組。結(jié)論: 連翹苷通過(guò)下調(diào)VEGF的表達(dá)、上調(diào)endostatin的表達(dá)而發(fā)揮抑制肺部腫瘤發(fā)展的作用。

[關(guān)鍵詞]連翹苷； Lewis肺癌； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； 內(nèi)皮抑制素

研究表明肺癌已成為世界上發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，主要分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌兩大類[1]。其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的80%～85%。由于肺癌很容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致早期診斷和治療效果不明顯，患者的5年生存率往往不足20%[2]。隨著環(huán)境污染日益加重以及生活習(xí)慣的改變，近年來(lái)我國(guó)的肺癌發(fā)生率迅速上升，預(yù)計(jì)到2025年，我國(guó)將成為世界第一肺癌大國(guó)[3]。常見(jiàn)的肺癌治療以手術(shù)為主，結(jié)合化療和放療，取得了一定的療效。但由于治療普遍缺乏針對(duì)患者病情的特異性，而放、化療常出現(xiàn)較強(qiáng)的毒副作用以及耐受性，往往難以取得進(jìn)一步的療效。另一方面，西方醫(yī)療手段聯(lián)合中醫(yī)中藥對(duì)腫瘤患者進(jìn)行治療也是我國(guó)特色之一。近年來(lái)隨著腫瘤分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，從基因的角度進(jìn)行研究，使得基因治療也有可能得以實(shí)現(xiàn)。本研究采用免疫組化方法研究連翹苷(phillyrin)對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成抑制因子內(nèi)皮抑制素(endostatin)蛋白表達(dá)的變化，并初步研究其機(jī)制。

材料和方法

1樣本來(lái)源

收集醫(yī)院2012年1月～2014年12月間手術(shù)切除的54例非小細(xì)胞肺癌組織(男性28例，女性26例)，另取癌旁正常組織36例，正常肺部組織28例，組織切除后立即置于-80 ℃液氮中冷凍；樣本年齡均大于18歲，中位年齡56.7歲；所有組織均經(jīng)過(guò)病理學(xué)專家確診，經(jīng)本院倫理委員會(huì)通過(guò)。

2材料

Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院；C57BL/6J小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；連翹苷購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度98%；VEGF和endostatin抗體購(gòu)自Abcam；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

3方法

3.1肺癌模型建立與實(shí)驗(yàn)分組將Lewis肺癌細(xì)胞株在37 ℃中復(fù)蘇，接種于10只C57BL/6J小鼠右肢腋窩皮下作為瘤源動(dòng)物。約10 d后，待小鼠右腋部皮下瘤體明顯隆起，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下剝離瘤組織，剪碎，研磨制備細(xì)胞懸液，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×1010/L。取此細(xì)胞懸液0.2 mL接種于40只C57BL/6J小鼠右肢腋窩皮下。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、模型組、連翹苷低劑量組、連翹苷中劑量組和連翹苷高劑量組。

3.2給藥方法空白對(duì)照組：C57BL/6J小鼠正常飲食；模型組：造模第1天，以0.2 mL無(wú)菌水灌胃，每日1次；連翹苷低劑量組：造模第1天，以5 g/kg，0.2 mL灌胃，每日1次；連翹苷中劑量組：造模第1天，以10 g/kg，0.2 mL灌胃，每日1次；連翹苷高劑量組：造模第1天，以10 g/kg，0.2 mL灌胃，每日2次。連續(xù)給藥20 d。于最后一次給藥后處死，取出肺部組織，標(biāo)記，置于-80 ℃液氮中冷凍備用。

3.3石蠟切片和HE染色將各C57BL/6J小鼠腫瘤組織置于4%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，分別用二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡10 min，梯度乙醇分別浸泡5 min，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，0.2%氨水返藍(lán)，伊紅染色，再次用乙醇脫水3 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ透明5 min，中性樹(shù)膠封固。顯微鏡下觀察各組織形態(tài)學(xué)變化。

3.4免疫組化染色法將各組織切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中脫蠟，梯度乙醇分別浸泡5 min，洗滌，置于3% H2O2去離子水孵育10 min，封閉，加入 I 抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌，加入Ⅱ抗，37 ℃孵育20 min，PBS洗滌，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，脫水透明，封片晾干。光鏡下觀察免疫組化切片染色結(jié)果，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。評(píng)分方法：陽(yáng)性細(xì)胞率≤1%為0分，2%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；無(wú)染色為0分，弱強(qiáng)度染色為1分，中等強(qiáng)度染色為2分，強(qiáng)染色為3分；以陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度之積進(jìn)行綜合判斷：0～1分為陰性(-)；2～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中等陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 15.0軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析(one-way ANOVA)行組間差異的統(tǒng)計(jì)推斷，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié)果

1VEGF和endostatin蛋白在臨床不同肺部組織的表達(dá)

VEGF和endostatin的陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色。在臨床收集的樣本中， VEGF的表達(dá)在正常組織中為弱陽(yáng)性，癌旁組織為中等陽(yáng)性，肺癌組織為強(qiáng)陽(yáng)性；endostatin的表達(dá)在正常組織中為中等陽(yáng)性，癌旁組織為弱陽(yáng)性，肺癌組織為陰性，見(jiàn)圖1。

2Lewis肺癌小鼠腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)的變化

空白對(duì)照組肉眼未發(fā)現(xiàn)腫物，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞排列規(guī)則，整齊，分布均勻。模型組肉眼見(jiàn)腫瘤體積巨大，不規(guī)則形狀，光鏡下瘤組織大片分布，排列緊密，細(xì)胞形狀不一。連翹苷低劑量組肉眼見(jiàn)腫瘤體積比模型組減小，光鏡下見(jiàn)瘤細(xì)胞密度降低，瘤組織片狀分布，未見(jiàn)顯著改變。連翹苷中劑量組肉眼見(jiàn)腫瘤體積顯著小于模型組與低劑量組，光鏡下瘤細(xì)胞明顯分散，排列疏松，呈大片壞死。連翹苷高劑量組肉眼見(jiàn)腫瘤體積比模型組明顯減小，瘤細(xì)胞密度明顯降低，部分核細(xì)胞固縮，見(jiàn)圖2。各組小鼠腫瘤重量和形態(tài)見(jiàn)圖3、4。

Figure 1.The protein expression of VEGF and endostatin in different lung tissues (immunohistochemical staining,×400). Mean±SD.n=10.*P<0.05vsnormal lung tissues.

圖1VEGF和Endostatin在不同肺部組織中的蛋白表達(dá)

Figure 2.Morphological observation in each group (HE staining,×40).

圖2各處理組的組織形態(tài)觀察

Figure 3.Statistical data of tumor weight in each group. Mean±SD.n=10*P<0.05vsmodel.

圖3各組小鼠腫瘤重量統(tǒng)計(jì)

3VEGF和endostatin蛋白在各組織中的表達(dá)

采用免疫組化染色法檢測(cè)連翹苷對(duì)Lewis肺癌小鼠中VEGF和endostatin蛋白表達(dá)的影響。隨連翹苷劑量的升高，VEGF的蛋白表達(dá)逐漸減弱，而endostatin的蛋白表達(dá)則逐漸減少,見(jiàn)圖5、6。

討論

腫瘤血管的生成是一個(gè)多因素多步驟的過(guò)程，包括了細(xì)胞增殖、遷移和胞外基質(zhì)降解等。多種惡性實(shí)體腫瘤均是血管依賴性的腫瘤，通常是由于血管異常增生，導(dǎo)致的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，主要取決于血管生成促進(jìn)因子和抑制因子二者之間的比例[4]。這兩類因子以VEGF和endostatin最具代表性。

Figure 4.Tumor size observation in each group.

圖4各處理組腫瘤大小

Figure 5.The protein expression of VEGF in the tumor tissues isolated from Lewis lung carcinoma treated with phillyrin (immunohistochemical staining,×400). Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖5Lewis肺癌小鼠給予連翹苷后腫瘤組織中VEGF的表達(dá)

Figure 6.The protein expression of endostatin in the tumor tissues isolated from Lewis lung carcinoma treated with phillyrin (immunohistochemical staining,×400). Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol.

圖6Lewis肺癌小鼠給予連翹苷后腫瘤組織中endostatin的表達(dá)

VEGF是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成和調(diào)節(jié)血管通透性的功能[5]。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在多種腫瘤中的表達(dá)水平顯著增加，與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[6-7]。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，都依賴于VEGF的作用，具有明顯的特異性。我們對(duì)臨床收集的肺部正常組織、癌旁組織和非小細(xì)胞肺癌組織的樣本進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示在肺癌組織中VEGF呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，顯著高于正常組織和癌旁組織，表明VEGF在肺癌組織中的表達(dá)具有特異性。給予Lewis肺癌小鼠不同劑量連翹苷后，肺癌組織中VEGF的表達(dá)下調(diào)，且與劑量呈負(fù)相關(guān)。提示連翹苷可能具有抑制肺癌組織中VEGF表達(dá)的作用，從而抑制腫瘤血管的進(jìn)一步生成。

Endostatin是內(nèi)源性血管生成抑制劑，特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移，誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制腫瘤血管的形成[8-9]。在多種研究中，endostatin被認(rèn)為是作用最強(qiáng)，特異性最高的血管生成抑制因子。研究表明endostatin通過(guò)抑制eNOS的激活，從而抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成，也能阻斷VEGF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路[10]。同樣地，我們也對(duì)肺部正常組織，癌旁組織和非小細(xì)胞肺癌組織的臨床樣本進(jìn)行了免疫組化染色，結(jié)果表明，肺癌組織中endostatin呈陰性表達(dá)，低于正常組織和癌旁組織，表明endostatin在肺癌組織中的表達(dá)同樣具有特異性。給予Lewis肺癌小鼠不同劑量連翹苷后，肺癌組織中endostatin的表達(dá)上調(diào)，且與劑量呈正相關(guān)。提示連翹苷可促進(jìn)肺癌組織中endostatin的表達(dá)，與下調(diào)肺癌組織中VEGF表達(dá)起協(xié)同作用，共同抑制腫瘤血管的生成。

連翹苷是中藥連翹的主要有效成分，已有研究表明連翹苷具有明顯的抗炎、解熱、內(nèi)毒素中和作用和抗氧化作用。由于連翹在我國(guó)的地理分布廣，可廣泛種植，具有很好的開(kāi)發(fā)價(jià)值。研究表明連翹苷元對(duì)免疫性大鼠纖維化有較好的治療作用[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，給予Lewis肺癌小鼠連翹苷治療后能顯著減少VEGF和增加endostatin的表達(dá)，提示連翹苷可抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)。再者，HE切片染色結(jié)果顯示，高劑量的連翹苷能顯著減少肝腫瘤的體積，瘤組織密度顯著減少，提示連翹苷具有抑制肝癌發(fā)展的作用。具體機(jī)制還需進(jìn)行下一步研究。綜上所述，本研究為連翹苷用于臨床肝癌治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Ulahannan SV, Brahmer JR. Antiangiogenic agents in combination with chemotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer[J]. Cancer Invest, 2011, 29(4): 325-337.

[2]van Loon J, van Baardwijk A, Boersma L, et al. Therapeutic implications of molecular imaging with PET in the combined modality treatment of lung cancer[J]. Cancer Treat Rev, 2011, 37(5): 331-343.

[3]潘博. 潘敏求主任醫(yī)師治療肺癌經(jīng)驗(yàn)[J]. 湖南中醫(yī)雜志，2010,26(3)：44-45.

[4]閆長(zhǎng)青，劉三光，戚誠(chéng),等.胰腺癌患者外周血VEGF和endostatin表達(dá)及意義[J].中國(guó)腫瘤臨床與康復(fù)，2011,18(4):293-295.

[5]段澤星，謝立群. VEGF在腫瘤生成和血管生成中的作用[J]. 世界華人消化雜志，2010, 18(27):2894-2900.

[6]Sullivan LA, Brekken RA. The VEGF family in cancer and antibody-based strategies for their inhibition [J]. MAbs, 2010, 2(2):165-175.

[7]Khromova N, Kopnin P, Rybko V, et al. Downregulation of VEGF-C expression in lung and colon cancer cells decelerates tumor growth and inhibits metastasis via multiple mechanisms[J]. Oncogene, 2012, 31(11):1389-1397.

[8]鐘曉剛，殷舞，黃順榮，等.載體肝干細(xì)胞分泌表達(dá)的Endostatin對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J]. 臨床肝膽病雜志，2011, 27(11):1203-1206.

[9]蔣曉東，戴鵬，吳瑾，等. 放療聯(lián)合周劑量重組人血管內(nèi)皮抑素對(duì)A549肺腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的研究[J]. 腫瘤，2010, 30(11):917-923.

[10]Gao P, Gao YJ, Liang HL. Effect of NF-κB inhibitor PDTC on VEGF and endostatin expression of mice with Lewis lung cancer[J]. Asian Pac J Trop Med, 2015, 8(3):220-224.

[11]王恩力，姚景春，劉錚.連翹苷元對(duì)大鼠免疫性肝纖維化的影響[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究，2015, 38(2):161-164.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of phillyrin on VEGF and endostatin expression in Lewis lung carcinoma

ZHENG Mo, JIANG Zhong-min

(DepartmentofPathology,TianjinFifthCentreHospital,Tianjin300450,China.E-mail:zhengzz1978@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of phillyrin on vascular endothelial growth factor (VEGF) and endostatin expression in lung tumor tissues isolated from Lewis lung carcinoma. METHODS: The expression of VEGF and endostatin in control individuals and the patients with lung cancer was determined by immunohistochemistry. In the animal experiment, 5 groups of animals were examined: control, tumor model, and tumor model with 3 different concentrations of phillyrin treatments. For preparation of transplanted tumor model, Lewis cells were subcutaneously injected into the right limb armpit of the nude mice. After that, phillyrin was administered via oral gavage once daily for 20 d at dose of 5 or 10 g/kg, or twice daily at 10 g/kg. Lung tumor tissues isolated from each group were observed by hematoxylin-eosin staining. VEGF and endostatin expression were examined by immunohistochemistry. RESULTS: VEGF expression was increased in lung tumor tissues as compared with normal and pericarcinous tissues, while endostatin expression was decreased. Phillyrin significantly inhibited the tumor size and tumor tissue density dose-dependently, which was accompanied with a decrease in VEGF expression and an increase in endostatin expression. CONCLUSION: Phillyrin inhibits the development of lung tumor through reducing VEGF expression and increasing endostatin expression.

[KEY WORDS]Phillyrin; Lewis lung carcinoma; Vascular endothelial growth factor; Endostatin

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)01- 0167- 06

[收稿日期]2015- 08- 17[修回日期] 2015- 09- 21

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81001001)

通訊作者△Tel： 022-65665599； E-mail： zhengzz1978@126.com

[中圖分類號(hào)]R734.2; R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.029