楊　雷，　劉　暖,　毛秉豫，　徐國昌，　葉松山，　張培華，　張瓅方

(南陽理工學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南 南陽 473004)

·短篇論著·

蛋白激酶D1促血管新生的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分析*

楊雷，劉暖,毛秉豫△，徐國昌，葉松山，張培華，張瓅方

(南陽理工學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河南 南陽 473004)

[摘要]目的： 探討蛋白激酶D1(PKD1)促血管新生的作用，為心肌梗死等缺血性疾病以PKD1為治療靶點(diǎn)提供新的思路。方法: 體外培養(yǎng)、分離和鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，觀察PKD1及其特異性阻斷劑CID755673對EPCs中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體KDR表達(dá)的影響。復(fù)制大鼠心肌梗死模型，分析PKD1及CID755673干預(yù)對大鼠心肌梗死后受損心肌組織病理形態(tài)學(xué)、微血管和內(nèi)皮細(xì)胞變化以及VEGF、KDR表達(dá)的影響。結(jié)果: EPCs體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，PKD1可明顯上調(diào)EPCs中VEGF和KDR的表達(dá)水平。大鼠心肌梗死動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PKD1干預(yù)后的大鼠心肌組織排列較為有序，結(jié)構(gòu)較為清晰，內(nèi)皮細(xì)胞胞膜光滑、完整，周細(xì)胞可見，心肌組織中的VEGF和KDR表達(dá)水平顯著上調(diào)。結(jié)論: PKD1有明顯的促血管新生作用，該作用可能是通過VEGF介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]蛋白激酶D1； 心肌梗死； 血管新生； 內(nèi)皮祖細(xì)胞； 血管內(nèi)皮生長因子

蛋白激酶D(protein kinase D, PKD)屬于鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性的絲氨酸/蘇氨酸激酶，家族成員主要包括PKD1、PKD2以及PKD3，參與多種組織細(xì)胞的遷移、增殖、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫反應(yīng)等[1-2]。PKD1還是腫瘤血管形成進(jìn)程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白之一，抗PKD1抑制腫瘤血管的成熟而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的治療策略已應(yīng)用于臨床并取得了較為積極的效果[3]。和腫瘤治療策略相反，促血管新生療法是心肌梗死治療的理想策略之一，PKD1既然是腫瘤血管新生的關(guān)鍵調(diào)控蛋白之一，是否也在缺血受損的心肌組織中發(fā)揮著重要的作用？是否有望成為心肌梗死治療的潛在靶點(diǎn)？

在本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究中，我們從體外細(xì)胞培養(yǎng)水平觀察到PKD1有明顯的促進(jìn)骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的黏附、遷移、增殖和血管形成能力的作用，并且上調(diào)EPCs中eNOS mRNA的表達(dá)和蛋白表達(dá)水平[4]。在此基礎(chǔ)上，我們擬進(jìn)一步探討PKD1對EPCs中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及含激酶插入?yún)^(qū)受體(kinase insert domain receptor, KDR)表達(dá)的影響，并從動物整體實(shí)驗(yàn)水平探討PKD1對心肌梗死后受損心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化以及VEGF、KDR表達(dá)的影響，為以“PKD1”為靶點(diǎn)治療心肌梗死提供更深入的理論支持。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動物、儀器、藥物與試劑

SD大鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，雄性，清潔級，8周齡，重約200～240 g，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(豫)2010-0002，動物質(zhì)量合格證號為1000142。

A2-1389型生物安全柜(Thermo Scientific)；164-5052型PowerPac HC 電泳儀及FACSCanto II型流式細(xì)胞儀(Bio-Rad)；Bullet Blender Storm組織細(xì)胞破碎儀(Next Advance)； T25組織勻漿機(jī)(IKA)；HX-100E型小動物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)；ERM-3100型半自動病理切片機(jī)(蘇州郝思琳科技有限公司)；TKY-BMB型石蠟包埋機(jī)(深圳博大精科技實(shí)業(yè)有限公司)；Nikon Tis型熒光顯微鏡及NIS-Elements Software BR分析系統(tǒng)(Nikon)； SU3500型高清掃描電子顯微鏡(HITACHI)。

PKD1購自Pierce；PKD1特異阻斷劑CID755673購自Med Chem Express；DNA酶 I、Dulbecco’s PBS、胎牛血清、膠原酶I購自上海寶曼生物科技有限公司；EBM-2培養(yǎng)基購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；VEGF、KDR抗體購自天津恒業(yè)生物科技有限公司；羊抗兔IgG、DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司；纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、FITC和DAPI購自北京碧橙藍(lán)生物科技有限責(zé)任公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1EPCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定及實(shí)驗(yàn)分組EPCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定參見本課題組前期的研究文獻(xiàn)[4]。提前用FN(50 mg/L)包被6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將EPCs用含2% 胎牛血清的EBM-2的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，每孔105個加入6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分3個組：空白對照組；PKD1(100 μg/L)處理組；PKD1+CID755673(100 μg/L)處理組，以下簡稱CID755673處理組。每組設(shè)置6個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2PKD1對EPCs中VEGF、 KDR mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響TRIzol法提取EPCs中總RNA，根據(jù)GenBank序列，分別設(shè)計(jì)VEGF、KDR的上、下游引物，VEGF的上游引物為5’-ATGAACTTTCTGCTCTCTTGGG-3’，下游引物為5’-CTCTCCTATGTGCTGGCTTTG-3’，產(chǎn)物長度354 bp；KDR上游引物為5’-TCACGGTTGGGCTACTGC-3’，下游引物為5’-AGACCTTCTGCCATCACG-3’，產(chǎn)物長度418 bp。每組細(xì)胞取2 μg總RNA，根據(jù)試劑盒的說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取2 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行普通PCR，擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；延伸5 min。取反應(yīng)產(chǎn)物10 μg進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后AlphaView SA軟件攝圖，并分析VEGF、KDR與β-actin的灰度比值。

2.3PKD1對EPCs中VEGF、KDR蛋白表達(dá)的影響應(yīng)用Next Advance Bullet Blender Storm組織細(xì)胞破碎儀將EPCs打碎，勻漿，4 ℃下12 000×g離心2 min，提取組織總蛋白后Bradford法測定蛋白濃度，取其中20 μg蛋白進(jìn)行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h后洗膜，標(biāo)記1∶1 000稀釋的VEGF、KDR的 I 抗，4 ℃過夜，洗膜，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶2 000稀釋)孵育1 h后TBST洗膜，沖洗后暗室曝光顯影。同時以β-actin蛋白表達(dá)水平作為內(nèi)參照。膠片經(jīng)成像分析系統(tǒng)掃描，并應(yīng)用AlphaView SA軟件分析各樣本與β-actin蛋白灰度的比值，記錄蛋白相對含量。

2.4心肌梗死模型建立及分組參照我們之前的研究[2]，采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎造模方法復(fù)制大鼠心肌梗死模型。術(shù)后存活達(dá)2 d以上的心肌梗死大鼠隨機(jī)被分為模型組、PKD1處理組、CID755673處理組，另設(shè)正常對照組，每組8只大鼠。PKD1處理組大鼠按照10 mg·kg-1·d-1的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射PKD1，模型組注射等量的生理鹽水，CID755673處理組大鼠在PKD1處理組的基礎(chǔ)上按照10 mg·kg-1·d-1的標(biāo)準(zhǔn)同時腹腔注射CID755673。連續(xù)飼養(yǎng)14 d后處死大鼠。

2.5HE染色下PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化的影響取大鼠術(shù)后的心尖部心肌組織，用液氮快速冷凍，之后用10%的甲醛浸泡固定，沿左室長軸的中點(diǎn)行組織切片，其厚度保持在4 μm左右。用去離子水清洗切片組織后，蘇木精染色3～5 min，再次用去離子水清洗后，置入含1% HCl的無水乙醇中固定，之后再用伊紅染色1～4 min，去離子水清洗干凈，無水乙醇固定后石蠟包埋，光學(xué)顯微鏡下觀察分析。

2.6電鏡下PKD1對心肌梗死大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化的影響剪取大鼠術(shù)后的心尖部梗死區(qū)少許心肌組織，用生理鹽水洗去血跡并移至盛滿碎冰的玻璃培養(yǎng)皿上，組織周圍保持有適量2.5%戊二醛，用雙面刀片迅速將組織切成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm小塊，立即移至2.5%戊二醛固定液中固定3 h后1%鋨酸固定，梯度脫水，環(huán)氧樹脂與丙酮包埋、聚合成塊，超薄切片(50 nm)，醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察、攝片。

2.7PKD1對心肌梗死大鼠VEGF和KDR mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響取出-80 ℃冰箱的凍存管中100 mg梗死區(qū)心肌組織，IKA-T 25勻漿機(jī)制成勻漿，4 ℃下12 000×g離心5 min，TRIzol法提取總RNA后進(jìn)行mRNA檢測。

2.8PKD1對心肌梗死大鼠心肌VEGF、KDR蛋白表達(dá)變化的影響組織勻漿的制作方法同2.7部分，常規(guī)方法提取勻漿組織總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度后進(jìn)行蛋白檢測。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1EPCs的鑒定

EPCs呈卵圓形、紡錘形或者不規(guī)則狀，EPCs結(jié)合FITC后呈現(xiàn)綠色，DAPI 復(fù)染后胞核呈藍(lán)色；CD133、CD34或KDR表達(dá)呈陽性，相關(guān)結(jié)果已在本課題組前期論文[4]中發(fā)表。

2PKD1對EPCs中VEGF和KDR mRNA及蛋白表達(dá)的影響

和對照組相比，PKD1處理組VEGF、KDR mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)，加入CID755673處理之后，EPCs中VEGF、KDR mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The effects of PKD1 on the mRNA and protein expression of VEGF and KDR in the EPCs.Mean±SD.n=6.**P<0.01vsPKD1 group.

圖1PKD1對EPCs中VEGF和KDR mRNA及蛋白表達(dá)的影響

3HE染色下PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響

正常對照組大鼠組織形態(tài)規(guī)整，細(xì)胞輪廓清晰。模型大鼠心肌組織排列錯亂，細(xì)胞輪廓模糊，有核溶解現(xiàn)象，壞死心肌組織呈現(xiàn)明顯的纖維化，形態(tài)學(xué)上清晰完整的血管少見；和模型組相比，PKD1處理組大鼠心肌組織排列相對有序，心肌細(xì)胞輪廓較為清晰，明顯可見形態(tài)學(xué)上清晰完整的血管;加入CID755673處理之后，心肌組織形態(tài)學(xué)接近模型組大鼠，見圖2。

Figure 2.The effects of PKD1 on the myocardial pathomorphology and myocardial ultrastructure in the rats with myocardial infarction.

圖2PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化的影響

4PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化的影響

正常對照組大鼠心肌組織排列整齊，閏盤清晰，內(nèi)皮細(xì)胞完整。模型組大鼠心肌組織排練紊亂，閏盤不太清晰，殘存的血管管壁內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重皺縮，體積明顯縮小，完整的內(nèi)皮細(xì)胞少見；和模型組比較，PKD1處理組大鼠心肌組織形態(tài)清晰、規(guī)則，血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜光滑完整，處在增殖狀態(tài)的胞核較多，周細(xì)胞可見；加入CID755673處理之后，內(nèi)皮細(xì)胞皺縮，胞膜模糊，周細(xì)胞消失，清晰完整的內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，見圖2。

5PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織VEGF和KDR mRNA及蛋白表達(dá)的影響

和正常對照組相比，模型組大鼠心肌組織VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平略有升高，KDR mRNA和蛋白表達(dá)水平略有降低，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；和模型組比較，PKD1處理組大鼠心肌組織VEGF、KDR mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)；加入CID755673處理之后，VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The effects of PKD1 on the mRNA and protein expression of VEGF and KDR in the rats with myocardial infarction. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsPKD1 group.

圖3PKD1對心肌梗死大鼠心肌組織VEGF和KDR mRNA及蛋白表達(dá)的影響

討論

在前期的實(shí)驗(yàn)研究中，我們分別從PKD1誘導(dǎo)和阻斷2個截然相反的角度證實(shí)了PKD1可以明顯促進(jìn)大鼠骨髓源性EPCs的黏附、遷移和血管形成能力，并且時間依賴性地促進(jìn)EPCs增殖[4]。骨髓源性EPCs的黏附、遷移和增殖是應(yīng)對心肌梗死等缺血性組織損傷的一種自然反應(yīng)，明顯促進(jìn)受損組織區(qū)域內(nèi)微血管的新生。本研究進(jìn)一步證實(shí)，PKD1可顯著上調(diào)骨髓源性EPCs中VEGF及其受體KDR的表達(dá)。VEGF是EPCs介導(dǎo)的血管新生的重要參與者，在血管新生和管腔形成中扮演著重要的角色[5-6]，小鼠[7]和成人[8]VEGF基因移植治療缺血受損心肌的療法均證實(shí)VEGF通過動員骨髓源性EPCs而在血管新生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在促血管新生的進(jìn)程中，VEGF的受體KDR介導(dǎo)的信號通路可活化絲裂原活化蛋白激酶相關(guān)途徑，誘導(dǎo)肌動蛋白的改組、內(nèi)皮細(xì)胞的趨化和遷移，增加細(xì)胞有絲分裂的能力，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[9]。同時，還可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞間及內(nèi)皮細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，表現(xiàn)出明顯的血管腔化作用和增加血管的通透性[10]。這表明，PKD1促大鼠骨髓源性EPCs黏附、增殖、遷移和血管形成能力的作用與VEGF及其受體KDR密切相關(guān)。

心肌梗死后心肌組織的缺血損傷激發(fā)促血管新生信號，生長因子、NO和內(nèi)皮細(xì)胞被激活，內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接松散，周細(xì)胞從血管壁分離，血管通透性增加，血漿蛋白外滲，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移提供了必要的基質(zhì)成分[11]。之后，在一種叫做“端細(xì)胞”的特異內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控下，微血管的“芽”出現(xiàn)，鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞增殖以拓展“芽”的長度，最終管腔形成，周細(xì)胞聚集以加固新形成的管腔的穩(wěn)定性[11]，這一進(jìn)程主要受VEGF及其受體KDR所誘導(dǎo)調(diào)控。本研究中PKD1可以明顯改善心肌梗死大鼠紊亂的心肌組織形態(tài)，促進(jìn)大鼠受損心肌組織微血管數(shù)量的增加，電鏡下超微結(jié)構(gòu)分析表明PKD1也可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的增生，這為受損心肌組織內(nèi)血管的新生提供了必要的條件。此外，增生的內(nèi)皮細(xì)胞和心肌梗死后心肌組織中殘存的正常細(xì)胞之間的“串話”調(diào)控著心肌細(xì)胞的收縮能力[12]，并且以一種依賴NO的作用方式對缺血損傷的心肌細(xì)胞起到藥理學(xué)意義上的保護(hù)作用[13]。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PKD1明顯上調(diào)梗死心肌組織中VEGF及其受體KDR的表達(dá)。VEGF家族成員在心肌梗死后的血管新生中發(fā)揮著極其重要的作用，VEGF與其受體KDR結(jié)合后可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖和遷移，為新生血管的形成提供了必要條件[14]。在人或者嚙齒類動物心肌梗死后缺血的心肌組織中，受缺氧或者牽張等因素的刺激誘導(dǎo)[15-16]，通過缺氧誘導(dǎo)因子-1的作用，VEGF被快速激活，促進(jìn)新生血管的管腔形成。這表明，PKD1促血管新生的作用可能是通過VEGF信號通路所介導(dǎo)的。

之前的研究表明，來自血管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF可以誘導(dǎo)PKD1的激活，從而在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移以及微血管的新生中發(fā)揮著重要的作用[17]，而本研究證實(shí)PKD1有顯著上調(diào)EPCs中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的作用。這表明，PKD1和VEGF之間可能存在著相互調(diào)控、相互促進(jìn)的作用。這也意味著，PKD1有明顯的促血管新生作用，有望成為繼VEGF之后缺血性心臟病新的治療靶點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Promoting angiogenesis of protein kinase D1 in vitro and in vivo

YANG Lei, LIU Nuan, MAO Bing-yu, XU Guo-chang, YE Song-shan, ZHANG Pei-hua, ZHANG Li-fang

(MedicalExperimentalCenter,NanyangInstituteofTechnology,Nanyang473004,China.E-mail:maobingyu2005@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of protein kinase D1 (PKD1) on promoting angiogenesis in vitro and in vivo, and to furnish a new idea on targeting PKD1 for the treatment of ischemic heart disease such as myocardial infarction. METHODS: The culture, isolation and identification of endothelial progenitor cells (EPCs) were performed in vitro. The effects of PKD1 and its specific blocking agent CID755673 on expression levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and kinase insert domain receptor (KDR) in EPCs were determined. The rat model of myocardial infarction was established, the intervention effects of PKD1 and CID755673 on morphology, changes of microvessels and endothelial cells, and the expression of VEGF and KDR in the impaired myocardial tissue were analyzed. RESULTS: PKD1 significantly upregulated the expression of VEGF and KDR in EPCs in vitro. Meanwhile, the structure of myocardial tissue was more regular and clear, the cytomembrane of endothelial cells were more smooth and integrity, the pericytes were visible, and the expression of VEGF and KDR was significantly increased in PKD1 treatment group in vivo.CONCLUSION: PKD1 has the ability of angiogenesis obviously, which might be mediated by VEGF.

[KEY WORDS]Protein kinase D1; Myocardial infarction; Angiogenesis; Endothelial progenitor cells; Vascular endothelial growth factor

[文章編號]1000- 4718(2016)01- 0146- 06

[收稿日期]2015- 04- 06[修回日期] 2015- 11- 24

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No. 81473438; No. 81202791)；河南省中醫(yī)內(nèi)科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科支撐課題(豫教高[2012]186號)

通訊作者△Tel: 0377-62071305； E-mail: maobingyu2005@126.com

[中圖分類號]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.025