張艷鳳，許勇，陳雷，胡俊，張學(xué)成，房偉，方澤民，肖亞中

1 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 2306012 安徽省微生物與生物催化工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230039

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海綿內(nèi)/共生稀有放線菌Dermacoccus sp. X4次級(jí)代謝產(chǎn)物分離純化及結(jié)構(gòu)解析

張艷鳳1,2，許勇1,2，陳雷1,2，胡俊1,2，張學(xué)成1,2，房偉1,2，方澤民1,2，肖亞中1,2

1 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601
2 安徽省微生物與生物催化工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230039

張艷鳳, 許勇, 陳雷, 等. 海綿內(nèi)/共生稀有放線菌Dermacoccus sp. X4次級(jí)代謝產(chǎn)物分離純化及結(jié)構(gòu)解析. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(5): 599–609.

Zhang YF, Xu Y, Chen L, et al. Isolation, identification and structural characterization of secondary metabolites from amarine sponge-derived rare actinobacterium Dermacoccus sp. X4. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 599–609.

摘 要:從中國南海西沙群島10 m深海水中采集得到一株未鑒定海綿樣品，對(duì)其進(jìn)行共附生微生物的分離，得到真菌及細(xì)菌共16株。通過分子生物學(xué)鑒定及菌株發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其中一株稀有放線菌皮生球?qū)倬闐ermacoccus sp. X4對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好抑菌活性。大量發(fā)酵制備該菌株發(fā)酵液，通過硅膠分配層析、ODS反相層析、SephadexTMLH-20凝膠過濾層析及C18反相層析等分離方法對(duì)發(fā)酵液成分進(jìn)行分離，并使用液相質(zhì)譜連用、一維核磁及二維核磁分析對(duì)分離得到的單一化合物進(jìn)行鑒定，確定二酮哌嗪類化合物1個(gè)，吲哚酸酯類化合物2個(gè)。本研究中吲哚酸酯類化合物為首次從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中得到，為豐富海洋微生物藥用資源作出貢獻(xiàn)。

關(guān)鍵詞:海綿共附生微生物，次級(jí)代謝產(chǎn)物，抑菌活性，分離純化，結(jié)構(gòu)解析

Received: September 10, 2015; Accepted: December 21, 2015

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2013AA092901), Scientific Research Foundation for Returned Scholars, Ministry of Education of China, the Introduction Project of Academic and Technology Leaders in Anhui University (No. 32030066), Innovative Research Team Program of 211 Project in Anhui University.

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2013AA092901)，教育部留學(xué)回國人員科研項(xiàng)目，安徽大學(xué)人才引進(jìn)計(jì)劃 (No. 32030066)，安徽大學(xué)211工程創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助。

海洋占據(jù)地球70%以上的面積，是新型海洋天然產(chǎn)物來源的巨大寶庫。自20世紀(jì)50年代Bergmann和Feeney首次從海綿Tethya crypta中獲得新穎的核酸衍生物以來[1-2]，此后每年都有上百種結(jié)構(gòu)新穎且具有良好活性的新化合物被報(bào)道[3]。

軟體動(dòng)物是海洋生物的重要成員，在海洋生態(tài)平衡中發(fā)揮功能。其中，海綿由于其固著生活方式，缺乏有效的物理性防御，在激烈的生存競(jìng)爭(zhēng)中,主要通過積聚或分泌多種具有攻擊性、甚至毒害性的次級(jí)代謝產(chǎn)物來維護(hù)種群的生存，是新型活性化合物的重要來源。目前，已經(jīng)從各類海綿中分離獲得多個(gè)具有顯著生物活性 (包括抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎等) 的化合物[4-19]。然而，海綿資源有限，對(duì)海綿資源的過量捕撈會(huì)破壞海洋的生態(tài)平衡。因此，來源于海洋軟體生物如海綿的藥源材料短缺已經(jīng)成為限制海洋藥物開發(fā)的瓶頸。

近年來，隨著對(duì)微生物及其宿主關(guān)系研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)，來源于海綿的某些活性物質(zhì)實(shí)際上是由與其共附生的微生物產(chǎn)生的[5]，無疑為海洋藥物藥源問題的解決提供了思路，即可以通過對(duì)共附生微生物的發(fā)酵制備來解決海洋藥物的藥源問題。

海綿共附生微生物物種多樣，具有廣泛的代謝產(chǎn)物多樣性[14-15]，是新型生物活性物質(zhì)的重要源泉[16-20]。目前，已從其共附生微生物中發(fā)現(xiàn)了若干結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如從海綿Ircinia sp.中分離得到一個(gè)二倍半萜硫酸胍鹽sulfircin，它具有抗真菌病原體活性(MIC為25 μg/mL)，它還能促進(jìn)神經(jīng)肌肉傳導(dǎo),也是乙酞膽堿酷酶的抑制劑[21]，來自海綿Xestospongia testudinaria共附生真菌Aspergillus sp.的2個(gè)新的倍半萜二聚體類化合物disydonols A和C，對(duì)HepG-2和Caski癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性[22]。

為了更多了解海綿共附生微生物及其代謝產(chǎn)物，前期我們從南海海域10 m深處采集若干海綿樣品。本研究中，我們對(duì)1株未鑒定海綿進(jìn)行了共附生微生物的分離鑒定，獲得16株微生物菌株，并對(duì)得到1株具有抑菌活性的稀有放線菌——皮生球菌屬菌株Dermacoccus sp. X4合成的活性化合物進(jìn)行初步分離純化及結(jié)構(gòu)解析。

1　材料與方法

1.1材料

SephadexTMLH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences)；YMC·GEL ODS-A-HG 12 nm S-50 μm (YMC Co.Ltd)；色譜純甲醇及乙腈 (Merck KGaA)；硅膠200–300目及硅膠H板 (青島海洋化工有限公司)。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (EYELAN-1100，Tokyo RikakikaiCo.LTD)；高效液相色譜儀 (AGILENT 1260)；液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀 (SATUKN2200)；核磁共振波譜儀 (DMX500，Bruker)。

1.3分離培養(yǎng)基

細(xì)菌使用伊莫遜氏培養(yǎng)基進(jìn)行分離；放線菌分別使用高氏培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基、淀粉干酪素瓊脂以及葡萄糖硝酸鹽瓊脂進(jìn)行分離；真菌使用馬丁培養(yǎng)基和察貝克氏瓊脂進(jìn)行分離[23]。

1.4海綿共附生微生物的分離

海綿樣品處理：取20 g海綿樣品，無菌海水沖洗表面后，用75%酒精漂洗4 min，然后再用無菌海水沖洗4次 (最后一次清洗用的水涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基上檢查表面消毒效果)，表面消毒的樣品在無菌條件下剪碎，加入50 mL無菌海水，經(jīng)漩渦振蕩器振蕩1 min后，靜置至澄清，取上清液備用。

吸取0.5 mL經(jīng)預(yù)處理的樣液于裝有4.5 mL無菌海水的試管中，充分混勻，按照10–1?10–5的比例稀釋，用微量移液器吸取100 μL經(jīng)稀釋后的樣品溶液至裝有各相應(yīng)分離培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用涂棒均勻涂布，涂好的平板置于28 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。生長(zhǎng)的菌落挑出后進(jìn)一步分離純化，并記錄菌落培養(yǎng)特征與個(gè)體形態(tài)。

1.5海綿共附生微生物的初步鑒定

細(xì)菌和真菌基因組DNA分別使用細(xì)菌和真菌基因組提取試劑盒 (康為世紀(jì)生物科技有限公司) 提取。使用引物27F及1492R (表1) 擴(kuò)增各細(xì)菌菌株的16S rRNA基因序列[24]；使用引物P1及P2 (表1) 擴(kuò)增各真菌菌株的ITS序列[25]。獲得的DNA序列使用NCBI中的Blast程序進(jìn)行相似性比對(duì)，確定各菌株的種屬歸類。

1.6海綿共附生微生物的抑菌活性測(cè)定

表1　擴(kuò)增菌株16S rRNA基因和ITS序列引物Table 1 The primers used to clone the 16S rRNA genes and ITS sequence of the strains

收集各菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期的發(fā)酵液備用。將活化好的金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus subsp., ATCC25923T)、大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC25922T)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans，ATCC14116T) 及白假絲酵母菌 (Candida albicans，ATCC10231T) 等4株待測(cè)菌的1 mL菌液 (OD600=1) 與100 mL伊莫遜氏培養(yǎng)基或沙氏瓊脂培養(yǎng)基 (麥芽糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，補(bǔ)充蒸餾水至1 L)混合均勻后制備待測(cè)瓊脂平板，將牛津杯置于瓊脂平板上，每板放置4個(gè)，分別加入100 μL無菌水 (陰性對(duì)照)、發(fā)酵上清原液、1/2濃度發(fā)酵原液、1/4濃度發(fā)酵原液，每種菌設(shè)置3個(gè)平行。細(xì)菌置于37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌置于28 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)并測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.7Dermacoccus sp. X4的分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株Dermacoccus sp. X4的16S rRNA基因序列在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/) 及模式菌比對(duì)軟件EzTaxon-e (http:// www.ezbiocloud.net/eztaxon)進(jìn)行比對(duì)后，在GenBank上獲取相關(guān)的16S rRNA基因序列，使用MEGA 5.0進(jìn)行比對(duì)分析后，采用Kimura 2-parameter模型和臨接法 (Neighbor-Joining)構(gòu)建菌株Dermacoccus sp. X4的系統(tǒng)發(fā)育聚類圖，進(jìn)一步確定該菌株的分類地位。

挑取菌株Dermacoccus sp. X4的單菌落在MT固體培養(yǎng)基平板上劃線，置于28 ℃條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)72 h后觀察其菌落大小及形態(tài)。取對(duì)數(shù)期的菌體用磷鎢酸染色后采用透射電鏡 (FEI Tecnai G2 F20, FEI) 觀察菌體大小及形狀。

1.8Dermacoccus sp. X4次級(jí)代謝產(chǎn)物提取

菌株發(fā)酵上清制備：對(duì)Dermacoccus sp. X4的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，選用生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期菌液作為種子液 (OD600=2.1)，按照1%接種量接種至馬丁培養(yǎng)基中 (400 mL培養(yǎng)基/1 L三角瓶)，28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)至90 h，收集發(fā)酵液，8 000×g離心去除菌體，得到澄清發(fā)酵液。

次級(jí)代謝產(chǎn)物的提?。翰捎玫润w積乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行萃取，分離小分子脂溶性物質(zhì)，等體積萃取3次，收集乙酸乙酯組分，將乙酸乙酯相蒸發(fā)濃縮去除有機(jī)溶劑，得到菌株發(fā)酵液粗浸膏。

1.9次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化

發(fā)酵液浸膏570 mg溶于適當(dāng)溶劑中，與5 g干硅膠拌樣，干法上樣后，采用硅膠200?300目層析柱 (內(nèi)徑40 mm，長(zhǎng)度400 mm) 進(jìn)行分離。用石油醚溶劑進(jìn)行裝柱后，采用梯度洗脫，洗脫體系分別為：石油醚∶丙酮=10∶0；9∶1；8∶2；7∶3；6∶4；5∶5；二氯甲烷∶甲醇= 9∶1；7∶3；5∶5；0∶10，每個(gè)梯度洗脫400 mL，收集各洗脫餾分，每管收集10 mL，并進(jìn)行薄層層析分析，根據(jù)層析情況合并相同組分，共得到17個(gè)組分。將質(zhì)量較大的組分15、16及17進(jìn)一步進(jìn)行凝膠色譜分離 (內(nèi)徑22 mm，長(zhǎng)度1 200 mm)，柱材料為SephadexTMLH-20，采用甲醇作洗脫液，洗脫3個(gè)柱體積 (400 mL)，收集各洗脫餾分，并進(jìn)行薄層層析分析，根據(jù)層析情況合并相同組分，將質(zhì)量較大的組分15-1、16-2及17-1過ODS離子交換色譜柱 (內(nèi)徑22 mm，長(zhǎng)度400 mm)，采用甲醇∶水=3∶7；4∶6；1∶1；7∶3及10∶0作洗脫劑，收集各洗脫餾分，并進(jìn)行薄層層析分析，根據(jù)層析情況合并相同組分，將質(zhì)量較大的組分15-1-B、16-2-A及17-1-4利用高效液相色譜進(jìn)行分離，采用C18半制備柱 (Pheno-menex Gemini 5uC18110A，250 mm×10.00 mm 5 micron)，210 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，分離得到化合物單體。

1.10化合物的結(jié)構(gòu)解析

取0.5 mg 樣品溶于0.5 mL色譜級(jí)甲醇中進(jìn)行質(zhì)譜分析；將各樣品分別以0.5 mL CH3DO溶解，反復(fù)交換2次。最后以0.7 mL CH3DO將樣品溶于核磁管，加入一滴氘代丙酮作為內(nèi)標(biāo)，在23 ℃下，利用1H-NMR、13C-NMR 等核磁技術(shù)對(duì)各樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1海綿共附生微生物的分離

基于16S rRNA及ITS編碼基因的序列聚類分析表明 (表2)，共得到16個(gè)不同種微生物菌株，分布于枝孢屬 (Cladosporium sp.)、叢赤殼屬 (Nectria sp.)、踝節(jié)菌屬 (Talaromyces sp.)、青霉菌屬 (Penicillium sp.)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus sp.) 等真菌，考克氏菌屬(Kocuria sp.)、皮生球菌屬 (Dermacoccus sp.)等放線菌及類芽孢桿菌屬 (Paenibacillus sp.)等細(xì)菌。

2.2分離菌株的抑菌活性

經(jīng)過培養(yǎng)觀察，分離菌株Dermacoccus sp.X4 (16S rRNA gene GenBank ID：KT944034)對(duì)金黃色葡萄球菌顯示出抑菌活性，且抑菌活性隨發(fā)酵液的濃度的增加而增強(qiáng)，菌株發(fā)酵液原液、倍比稀釋至1/2及1/4的發(fā)酵液的抑菌圈直徑分別為：25 mm、23 mm及19 mm (圖1)。

表2　海綿分離菌株的16S rRNA基因和ITS序列鑒定Table 2 The identification of strains isolated from sponge based on 16S rRNA gene and ITS sequence

圖1　Dermacoccus sp. X4對(duì)新型隱球菌 (A)、白假絲酵母菌 (B)、大腸桿菌 (C) 及金黃色葡萄球菌 (D)的抑制作用Fig. 1 The inhibitory effects of Dermacoccus sp. X4 fermentation broth on C. neoformans (A), C. albicans (B), E. coli (C), and S. aureus subsp. (D). NC: negative control; FL: fermentation liquor.

2.3Dermacoccus sp. X4的分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)鑒定

基于菌株Dermacoccus sp. X4的16S rRNA基因序列構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育聚類圖(圖2)，系統(tǒng)發(fā)育聚類圖顯示，該菌株與已經(jīng)報(bào)道的模式菌株Dermacoccus nishinomyaensis DSM20448T親緣關(guān)系最近，且與Dermacoccus屬的其他幾個(gè)種也具有很近的親緣關(guān)系，因此確定該菌株歸屬于Dermacoccus sp.。

Dermacoccus sp. X4為不運(yùn)動(dòng)的放線菌，在28 ℃條件下，在馬丁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)72 h后，菌落呈規(guī)則圓形，直徑約為1 mm，淡黃色，表面光滑濕潤(rùn)，中部隆起，為表面有光澤的克隆。電鏡觀察菌體為橢圓形，直徑約為0.5–1.5 μm(圖3)。

圖2　菌株Dermacoccus sp. X4的系統(tǒng)發(fā)育聚類圖 (鄰接法)Fig. 2 The Neighbor-Joining tree of strain Dermacoccus sp. X4.

圖3　菌株Dermacoccus sp. X4的菌落 (A) 和菌體(B) 形態(tài)Fig. 3 The morphology of the clony (A) and the cell (B) of Dermacoccus sp. X4.

2.4Dermacoccus sp. X4次級(jí)代謝產(chǎn)物分離

通過大量搖瓶發(fā)酵，獲得Dermacoccus sp. X4發(fā)酵液10 L，得到乙酸乙酯萃取浸膏570 mg。經(jīng)過各分離技術(shù)的綜合運(yùn)用，最終獲得6個(gè)單一化合物 (表3和圖4)。

2.5Dermacoccus sp. X4次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析

化合物X4-15：

1H-NMR (600 MHz，MeOD) δ:8.10 (1H，d，J=7.44 Hz，4-H)，7.86 (1H，s，2-H)，7.38 (1H，d，J=7.80 Hz，7-H)，7.13 (2H，m，5-H，6-H)；

表3　單一化合物質(zhì)量Table 3 The quantities of the purified compounds

圖4　單一化合物HPLC及TLC分析圖譜Fig. 4 The high performance liquid chromatography (HPLC) and thin layer chromatography (TLC) spectra of the purified compounds.

13C-NMR (150 MHz，MeOD) δ:138.17 (C-8)，132.53 (C-2)，127.88 (C-9)，123.19 (C-6)，122.26 (C-4)，121.91 (C-5)，112.63 (C-7)。該化合物為白色粉末，質(zhì)譜顯示該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為149，表明其含有N元素，推測(cè)其分子式為C8H7NO2。

結(jié)合1H-NMR譜圖，發(fā)現(xiàn)氫的出峰位置均在δ6.0–8.5 (一般苯環(huán)上的氫出峰位置) 左右，另外δ7.86處為一單峰，故判斷該化合物的骨架為吲哚結(jié)構(gòu)。由1H-1HCOSY圖譜可知，H-4和H-5相關(guān)，H-5和H-6相關(guān)，H-6和H-7相關(guān)，再由HMBC譜圖和HMQC譜圖可知，H-4/C-4，H-4/C-6，H-4/C-8，H-2/C-2，H-2/C-8，H-2/C-9，H-7/C-7，H-7/C-9，H-7/C-5，H-5/C-5，H-5/C-7，H-5/C-9，H-6/C-6，H-6/C-8，H-6/C-4，可判斷該化合物為吲哚結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜信息表明該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為149，故確定該化合物為3-hydroperoxy-1H-indole，將該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]比較，確定該化合物結(jié)構(gòu)如下：

化合物X4-16A：

1H-NMR (600 MHz，MeOD) δ:7.52 (1H，d，J=8.34 Hz，4-H)，7.31 (1H,d，J=7.74 Hz，7-H)，7.14 (1H，s，2-H)，7.06 (1H，m，6-H)，6.98 (1H，m，5-H)，3.69 (2H，s，10-H)，3.63 (1H，m，2′-H)，3.56 (2H，m，1′-H)，3.50 (2H，m，3′-H)；

13C-NMR (150 MHz，MeOD) δ:179.38 (C-11)，138.15 (C-8)，128.76 (C-9)，124.53 (C-2)，122.35 (C-6)，119.72 (C-5)，119.48 (C-4)，112.16 (C-7)，109.62 (C-3)，73.86 (C-2′)，64.40 (C-1′，3′)，32.45 (C-10)。

化合物為白色粉末，分子量256，推測(cè)其分子式為C13H14NO4。將該化合物的核磁數(shù)據(jù)與X-4-2-15B比較，發(fā)現(xiàn)低場(chǎng)信號(hào)基本一樣，而是在高場(chǎng)位置增加了幾組峰，故初步判斷該化合物的骨架為一個(gè)吲哚結(jié)構(gòu)。由1H-1HCOSY圖譜可知，H-4和H-5相關(guān)，H-5和H-6相關(guān)，H-6 和H-7相關(guān)，再由HMBC譜圖和HMQC譜圖可知，H-4/C-4，H-4/C-3，H-4/C-6，H-4/C-8，H-4/C-9，H-4/C-5，H-4/C-7，H-7/C-7，H-7/C-9，H-7/C-5，H-2/C-2，H-2/C-10，H-2/C-3，H-2/C-8，H-2/C-9，H-6/C-6，H-6/C-4，H-6/C-7，H-5/C-5，H-5/C-7，H-5/C-9，判斷該化合物為一個(gè)在3號(hào)位被取代的吲哚結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步分析δ：3.0–4.0的高場(chǎng)區(qū)域，結(jié)合氫譜、碳譜以及DEPT135譜圖可發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域?yàn)?個(gè)叔碳，3個(gè)仲碳。由HMBC譜圖和HMQC譜圖可知，H-10/C-10，H-10/C-11，H-10/C-3，H-10/C-4，H-10/C-9，H-2′/C-2′，H-2′/C-1′，H-2′/C-3′，H-1′/C-1′，H-1′/C-2′，H-1′/C-10，H-3′/C-3′，H-3′/C-2′，從而判斷被取代部分為一個(gè)甘油酯片段，將以上兩個(gè)片段結(jié)構(gòu)按HMBC給出相關(guān)性，結(jié)合HMQC、1H-1HCOSY圖譜數(shù)據(jù)，確定該化合物為3-吲哚乙酸甘油酯，將該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]比較，確定該化合物結(jié)構(gòu)如下：

化合物X4-17-4：

1H-NMR (600 MHz，MeOD) δ:7.02 (2H，d，J=8.10 Hz，2′,6′-H)，7.02 (2H，d，J=8.16 Hz，3′，5′-H)，4.35 (1H，s，3-H)，4.03 (1H，m，8-H)，3.53 (1H，m，5-H)，3.31 (1H，m，5-H)，3.03 (2H，m，10-H)，2.07 (1H，m，7-H)，1.78 (2H，m，6-H)，1.20 (1H，m，7-H)；

13C-NMR (150 MHz，MeOD) δ:170.77 (C-1)，166.94 (C-4)，157.67 (C-4′)，132.12 (C-2′，6′)，127.61 (C-1′)，116.17 (C-3′，5′)，60.04 (C-8)，57.89 (C-3)，45.91 (C-5)，37.65 (C-10)，29.39 (C-7)，22.71 (C-6)?；衔餅榘咨勰?，從質(zhì)譜圖上可以看出該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為260；從碳譜上看，該化合物有14個(gè)碳原子，推測(cè)其分子式為C14H16N2O3。

由1H-NMR譜圖中的δ:7.02 (2H，d，J=8.10 Hz)，7.02 (2H，d，J=8.16 Hz)，并通過1H-1HCOSY譜圖知其相互耦合，判斷該化合物存在一個(gè)1，4取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)。另外，由13C-NMR譜圖中的δ:170.77和δ:166.94可判斷該化合物還存在2個(gè)羰基。由1H-1HCOSY圖譜可知H-3 和H-10相關(guān)，H-8和H-7相關(guān)，H-5和H-6相關(guān)，H-6和H-7相關(guān)，再由HMBC譜圖和HMQC譜圖可知，H-2′，6′/C-2′，6′，H-2′，6′/C-10，H-2′，6′/C-3′，5′，H-2′，6′/C-4′，H-3′，5′/C-3′，5′，H-3′，5′/C-1′，H-3′，5′/C-4′，H-3/C-3，H-3/C-10，H-3/C-1′，H-3/C-4，H-8/C-8，H-8/C-7，H-8/C-1，H-5/C-5，H-5/C-6，H-5/C-7，H-，10/C-10，H-10/C-1′，H-10/C-3，H-10/C-4，H-7/C-7，H-7/C-6，H-7/C-5，H-7/C-8，H-7/C-1，H-6/C-6，H-6/C-7，H-6/C-5，H-6/C-8，綜上，判斷該化合物為3-(4-hydroxybenzyl) hexahydropyrrolo-[1,2-a]pyrazine-1,4-dione。將該化合物的核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]比較，確定該化合物結(jié)構(gòu)如下：

3　討論

對(duì)從中國南海西沙群島10 m深海水中采集得到1株未鑒定海綿樣品進(jìn)行共附生微生物分離，得到1株對(duì)金黃色葡萄球菌等具有抑菌活性的菌株Dermacoccus sp. X4，對(duì)該菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步分離，得到了6個(gè)單一化合物，對(duì)其中3個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。結(jié)果表明，這3個(gè)化合物分別為：1) 3-hydroperoxy-1H-indole；2) 3-吲哚乙酸甘油酯；3) 3-(4-hydr-oxybenzyl) hexahydropyrrolo [1,2-a]pyrazine-1,4-dione。其中化合物1) 和2)為首次從微生物代謝產(chǎn)物中分離鑒定。由于本次研究中獲得的這3個(gè)化合物的純品質(zhì)量分別為2.0 mg、1.1 mg及14.6 mg，質(zhì)量較小，所以未對(duì)純品化合物的抗菌活性進(jìn)行測(cè)定。但根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研的結(jié)果，Golubev和Suvorov對(duì)化合物1) 及2) 進(jìn)行了合成，發(fā)現(xiàn)其具有抗結(jié)核分支桿菌活性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)活性，并且作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[26-27]，但是由于化學(xué)合成成本高且步驟繁瑣，限制了其應(yīng)用開發(fā)。對(duì)化合物3) 的研究，有諸多抗菌、抗腫瘤及免疫活性的報(bào)道[28-30]。該研究為這3種活性化合物的制備提供了新的技術(shù)途徑，也進(jìn)一步表明海洋微生物是獲取活性化合物的重要資源。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Isolation, identification and structural characterization of secondary metabolites from amarine sponge-derived rare actinobacterium Dermacoccus sp. X4

Yanfeng Zhang1,2, Yong Xu1,2, Lei Chen1,2, Jun Hu1,2, Xuecheng Zhang1,2, Wei Fang1,2, Zemin Fang1,2, and Yazhong Xiao1,2
1 School of Life Science, Anhui University, Hefei 230601, Anhui, China
2 Anhui Provincial Engineering Technology Research Center of Microorganisms and Biocatalysis, Hefei 230039, Anhui, China

Abstract:We isolated and identified the symbiotic and adnascent microorganisms from an unidentified sponge collected from 10-meter-deep seawater of the Paracel Islands in China. A total of 16 strains were obtained and identified. Through bacteriostatic activity assay, one of the strains, Dermacoccus sp. X4, was found to effectively inhibit the growth of Staphylococcus aureus. Subsequently, its secondary metabolites were purified by silica gel partition, octadecylsilane (ODS) reverse phase, SephadexTMLH-20 size exclusion, and C18 reverse phase chromatography. Using liquid chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance, three of the purified compounds were structurally characterized to be one 3-(4-hydroxybenzyl) hexahydropyrrolo [1,2-a]pyrazine-1,4-dione and two indole acid glycerides. This is the first report about indole acid glyceride isolated from microbial secondary metabolites, enriching marine drug candidate resources.

Keywords:sponge associated microorganism, secondary metabolite, bacteriostatic activity, isolation and purification, structural characterization

Corresponding author:Yazhong Xiao. Tel: +86-551-63861861; E-mail: yzxiao@ahu.edu.cn