韓麗榮，程代，王莉蕊，王春玲

天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457

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灰樹花胞外多糖的結(jié)構(gòu)及免疫調(diào)節(jié)活性

韓麗榮，程代，王莉蕊，王春玲

天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457

韓麗榮, 程代, 王莉蕊, 等. 灰樹花胞外多糖的結(jié)構(gòu)及免疫調(diào)節(jié)活性. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(5): 648–656.

Han LR, Cheng D, Wang LR, et al. Structure and immunomodulatory activity of extracellular polysaccharide from Grifola frondosa. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 648–656.

摘 要:對灰樹花胞外多糖A組分 (EXGFP-A) 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和免疫活性的研究。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，EXGFP-A是一種主要含有葡萄糖的吡喃型中性多糖。氣相結(jié)果說明EXGFP-A的單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，摩爾比為0.28∶0.31∶0.30∶0.06∶7.98∶0.61。MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazo-lium bromide)比色實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)EXGFP-A濃度為80 μg/mL，作用48 h時，RAW264.7細(xì)胞增殖指數(shù)達(dá)到最大值，為137.5%。吖啶橙 (AO) 染色結(jié)果表明EXGFP-A能夠激活RAW264.7細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)部核酸代謝水平。EXGFP-A在一定濃度范圍內(nèi)，可以提高RAW264.7細(xì)胞中NO的釋放量，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ細(xì)胞因子以及細(xì)胞中iNOS的mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果表明，EXGFP-A具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，為灰樹花胞外多糖的結(jié)構(gòu)分析和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞:灰樹花多糖，結(jié)構(gòu)分析，RAW264.7細(xì)胞，免疫活性

Received: September 15, 2015; Accepted: November 30, 2015

Supported by: Key Technologies Research and Development Program of China (No. 2012BAD33B04), Key Projects of Tianjin Natural Science Foundation (No. 13JCZDJC29800).

國家科技支撐計(jì)劃 (No. 2012BAD33B04)，天津應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 13JCZDJC29800) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-07 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160107.1443.001.html

灰樹花Grifola frondosa又名貝葉多孔菌、栗蘑，俗稱云蕈、日本稱舞茸，屬擔(dān)子菌亞門層菌綱非褶菌目多孔菌科樹花菌屬?；覙浠ㄊ且环N藥、食兼用的珍稀真菌，具有多種生理活性[1]，如抗腫瘤[2-3]、調(diào)節(jié)血糖[4]、抗氧化[5]、抗輻射[6]及免疫調(diào)節(jié)[7]等。近年來，灰樹花的保健功能及藥用價值受到人們重視，并已證明灰樹花多糖是灰樹花中主要的活性成分[8-9]，但對于灰樹花多糖單一組分的結(jié)構(gòu)分析及免疫活性的研究還相對較少。巨噬細(xì)胞作為一種重要的免疫細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體中，參與機(jī)體的特異性和非特異性免疫反應(yīng)，可作為免疫活性的研究對象。

本文對分離純化后的灰樹花胞外多糖A組分 (EXGFP-A) 進(jìn)行了基本的結(jié)構(gòu)分析以及免疫活性研究，為灰樹花胞外多糖的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

Grifola frondosa菌種：天津科技大學(xué)菌種保藏中心提供，編號39025。

RAW264.7細(xì)胞株：購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2EXGFP-A的結(jié)構(gòu)分析

1.2.1EXGFP-A的紅外光譜分析

1 mg EXGFP-A樣品以KBr壓片，室溫條件下進(jìn)行紅外掃描測定。

1.2.2EXGFP-A的掃描電鏡分析

取適量凍干的EXGFP-A粉末均勻輕薄地平鋪在樣品臺導(dǎo)電膠的表面，吹去浮樣，置于離子濺射儀中進(jìn)行真空噴金處理，然后掃描電鏡觀察[10]。

1.2.3 EXGFP-A的單糖組成分析

采用糖醇乙酸酯衍生化方法對EXGFP-A的水解產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜測定，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選擇鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6種單糖作為標(biāo)準(zhǔn)品單糖。氣相色譜條件：色譜柱：DB-17(30 m×0.32 mm× 0.5 m)；檢測器：氫火焰離子化檢測器 (FID)；載氣：N2，1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；柱溫：190 ℃；檢測器溫度：280 ℃。

1.3EXGFP-A對RAW264.7增殖活性的影響

本實(shí)驗(yàn)以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為研究對象，研究EXGFP-A的免疫調(diào)節(jié)活性。采用MTT法[11]：EXGFP-A作用RAW264.7一定時間后，使用酶標(biāo)儀測定570 nm波長處各孔的吸光度。細(xì)胞增殖率=OD加藥/OD對照×100%[12]。

1.4EXGFP-A對RAW264.7細(xì)胞中DNA、RNA的影響

將無菌潔凈的蓋玻片置入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入濃度為5×105個/mL的RAW264.7細(xì)胞懸液1 mL，待細(xì)胞處于完全貼壁狀態(tài)后，加入終濃度分別為0、40、80、160 μg/mL 的EXGFP-A，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。當(dāng)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出細(xì)胞爬片，PBS緩沖液洗滌，Carony’s液 (乙醇：冰醋酸：氯仿=6∶1∶3 (V/V/V)) 固定細(xì)胞10 min，以1%醋酸進(jìn)行酸化，加入0.01% AO溶液進(jìn)行細(xì)胞染色，避光條件下室溫放置20 min，0.1 mol/L 氯化鈣溶液分色30?60 s。PBS緩沖液洗滌后，將細(xì)胞爬片置于潔凈的載玻片上，多功能熒光顯微鏡下觀察并采圖。

1.5EXGFP-A對RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響

NO的合成是巨噬細(xì)胞被激活的重要標(biāo)志之一。以NO標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)，完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算各組樣品中NO濃度[13]。

1.6EXGFP-A對RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及對細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)的影響

1.6.1RAW264.7細(xì)胞RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按照北京全式金生物技術(shù)有限公司總RNA提取試劑TransZol說明書，無菌條件下進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。使用北京全式金公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒來進(jìn)行cDNA的合成，步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。體系完全混勻后，于PCR儀上42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 min，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于–20 ℃凍存。

1.6.2聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)

采用委托給上海生工生物工程公司合成的相關(guān)系列引物，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并以β-actin為內(nèi)參。相關(guān)引物序列設(shè)計(jì)如表1所示。

本實(shí)驗(yàn)中聚合酶鏈反應(yīng)體系總體積為50 μL，加樣體系：cDNA 2 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL、10×緩沖液 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、TransTaq HiFi DNA聚合酶 0.5 μL，最后加入ddH2O，使體系終體積為50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55?60 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，30?35個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。

1.6.3瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠 (1%) 制備：稱取0.4 g瓊脂糖粉末，溶于40 mL 1×TAE溶液，微波完全融化后，冷卻至50–60 ℃，加入4 μL核酸染料，充分搖勻。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2 μL 6×DNA上樣緩沖液混勻后上樣。另外，Marker上樣量為5 μL。電泳電壓設(shè)定為80 V，電泳結(jié)束后，使用凝膠成像儀拍照分析。

表1　PCR引物序列Table 1 Primers sequence of PCR

2　結(jié)果與討論

2.1EXGFP-A的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1EXGFP-A的紅外光譜分析

由圖1可知，在3 600?3 200 cm–1出現(xiàn)一寬峰是O-H伸縮振動；2 934 cm–1為C-H伸縮振動；1 652 cm–1、1 400?1 200 cm–1是C-H的變角振動，以上這幾處特征吸收峰證明該化合物為糖類物質(zhì)[14]。而在1 700 cm–1–1 775 cm–1范圍內(nèi)無明顯吸收峰，表明樣品中不含羧基，即該多糖是一種中性糖。1 870–1 540 cm–1范圍內(nèi)存在的特征吸收峰是屬于由C=O伸縮振動引起的。1 069 cm–1處的吸收峰表明EXGFP-A中存在3-6-內(nèi)醚橋，即樣品中含有3-6-內(nèi)醚-半乳糖[15]，而852 cm–1處形成的吸收峰表明組成的單糖為α-D-葡萄吡喃糖[16]，即EXGFP-A是屬于吡喃型多糖。此外，807 cm–1處的特征峰則說明在多糖分子中存在甘露糖苷鍵[17]，619 cm–1處的吸收峰表明多糖中含有葡萄糖殘基。

圖1　EXGFP-A紅外光譜分析圖譜Fig. 1 IR spectroscopic analysis of EXGFP-A.

2.1.2EXGFP-A的掃描電鏡分析

如圖2所示，當(dāng)粉末狀態(tài)的EXGFP-A平鋪在樣品臺上，經(jīng)電鏡掃描之后，顯示出其形態(tài)多為棒狀、片層狀，并且這些片層結(jié)構(gòu)上附有許多刺狀不規(guī)則、大小不均一的碎屑。

2.1.3EXGFP-A的單糖組成分析

六種標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的氣相色譜圖如3A所示，各標(biāo)準(zhǔn)單糖的分離效果很好。EXGFP-A的氣相色譜分析圖如3B所示，對比EXGFP-A的出峰時間與混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的時間，說明EXGFP-A主要是由葡萄糖所組成，同時含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖以及少量的甘露糖。根據(jù)峰面積計(jì)算出這6種單糖 (鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖) 的摩爾比為0.28∶0.31∶0.30∶0.06∶7.98∶0.61。這與文獻(xiàn)報道[18]的灰樹花均一多糖主要含有葡萄糖相吻合，而且本研究中的EXGFP-A中葡萄糖含量最高，和文獻(xiàn)報道的研究結(jié)果也相一致。

圖2　EXGFP-A的掃描電鏡分析 (×500和×2 000)Fig. 2 SEM analysis of EXGFP-A (magnification: 500 and 2 000).

圖3　氣相色譜分析圖Fig. 3 Gas chromatography analysis. (A) Standard sugars. (B) EXGFP-A. 1: rhamnose; 2: arab sugar; 3: xylose; 4: mannose; 5: glucose; 6: galactose; 7: inositol.

2.2EXGFP-A對RAW264.7細(xì)胞增殖指數(shù)的影響

由MTT實(shí)驗(yàn)[19]檢測EXGFP-A作用濃度對RAW264.7細(xì)胞增殖指數(shù)的影響，結(jié)果如圖4A所示，EXGFP-A在一定的濃度范圍內(nèi)，RAW264.7細(xì)胞的增殖活性與EXGFP-A的作用濃度呈正相關(guān)。在EXGFP-A作用濃度為80 μg/mL時，RAW264.7細(xì)胞的增殖指數(shù)達(dá)到最大值137.5%。如圖4B所示，當(dāng)EXGFP-A作用濃度為80 μg/mL時，通過不同培養(yǎng)時間 (0、12、24、36、48、72 h) 作用于RAW264.7細(xì)胞。結(jié)果表明，在EXGFP-A作用48 h內(nèi)，細(xì)胞的數(shù)量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。當(dāng)EXGFP-A作用時間達(dá)到48 h時，增殖效果達(dá)到最大。

以上結(jié)果說明，EXGFP-A能夠增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的增殖活性。EXGFP-A作用于RAW264.7細(xì)胞的最佳濃度為80 μg/mL，最佳作用時間為48 h。

圖4　EXGFP-A對RAW264.7細(xì)胞增殖指數(shù)的影響Fig. 4 Effects of EXGFP-A on proliferation index of RAW264.7 cells. (A) Concentration. (B) Time. n=6,±s, compared with the control group, *P<0.05, **P<0. 01.

2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

吖啶橙 (AO) 是一種能和細(xì)胞中的核酸相結(jié)合并產(chǎn)生特異性熒光的染料。當(dāng)吖啶橙與細(xì)胞核內(nèi)的DNA和RNA結(jié)合，呈綠色熒光。如圖5所示，加入80 μg/mL的EXGFP-A誘導(dǎo)細(xì)胞48 h之后，細(xì)胞處于激活狀態(tài)，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞數(shù)目也增多，細(xì)胞核區(qū)的綠色熒光亮度增強(qiáng)，說明80 μg/mL的EXGFP-A作用下，RAW264.7細(xì)胞被激活，核酸代謝能力增強(qiáng)。

2.4EXGFP-A對RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

巨噬細(xì)胞[20]是產(chǎn)生NO的重要的免疫細(xì)胞之一，在免疫系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，NO作為一個關(guān)鍵介質(zhì)，它的合成可作為巨噬細(xì)胞被激活的一個重要標(biāo)志。

如圖6所示，處于正常狀態(tài)的對照組細(xì)胞產(chǎn)生NO濃度較低，而加入不同濃度的EXGFP-A與RAW264.7細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)EXGFP-A均能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞分泌產(chǎn)生NO。結(jié)果表明，EXGFP-A能夠誘導(dǎo)并且激活RAW264.7細(xì)胞，促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌NO，通過增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力，從而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

圖5　EXGFP-A作用RAW264.7細(xì)胞的AO染色(×400)Fig. 5 AO staining of RAW264.7 treated with EXGFP-A (×400).

圖6　EXGFP-A作用濃度對RAW264.7細(xì)胞NO表達(dá)量的影響Fig. 6 Effects of EXGFP-A concentration on the production of NO in RAW264.7 cells. n=6,± s　, compared with the control group, *P<0.05, **P<0. 01.

2.5EXGFP-A對RAW264.7細(xì)胞免疫因子mRNA表達(dá)水平的影響

由上述結(jié)果可知，EXGFP-A可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖活性。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從基因水平檢測了EXGFP-A對 RAW264.7細(xì)胞中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12以及IFN-γ[21]的影響，此外還檢測了EXGFP-A對 RAW264.7細(xì)胞中iNOS[22]在mRNA水平上的影響。

RT-PCR結(jié)果如圖7所示，對照組的正常細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ和iNOS的mRNA幾乎不表達(dá)或表達(dá)量極低。不同濃度的 EXGFP-A (20、40、80、160 μg/mL) 與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)均能顯著上調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ和iNOS的產(chǎn)生，在一定的濃度范圍內(nèi)(20–80 μg/mL)，隨著EXGFP-A濃度的增加，細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ和iNOS 的mRNA的表達(dá)量均相應(yīng)增加，當(dāng)EXGFP-A作用濃度達(dá)到80 μg/mL時，表達(dá)量均達(dá)到最大值。

RT-PCR結(jié)果表明：EXGFP-A能夠激活RAW264.7細(xì)胞，促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 和IL-12等細(xì)胞因子的分泌以及上調(diào)細(xì)胞中iNOS的mRNA表達(dá)水平，并且在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯的濃度依賴性。證明EXGFP-A可以通過多途徑激活RAW264.7細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫活性。

3　結(jié)論

灰樹花作為近年來開發(fā)研究的珍貴真菌之一，已有相關(guān)研究表明其在多種生物活性方面均有顯著功效。國內(nèi)外對于灰樹花的研究主要集中在灰樹花子實(shí)體多糖的功能學(xué)評價，而有關(guān)灰樹花多糖的結(jié)構(gòu)和免疫活性的研究相對較少。本文對灰樹花多糖的單一組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，并研究其免疫活性。

圖7　EXGFP-A作用濃度對RAW264.7細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響Fig. 7 Effects of EXGFP-A concentration on the mRNA expression of cytokine in RAW264.7 cells. n=6, x± s, compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.

在本研究中，灰樹花胞外多糖EXGFP-A是一種主要含有葡萄糖的吡喃型中性多糖，單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，摩爾比為0.28: 0.31: 0.30: 0.06: 7.98: 0.61。EXGFP-A能夠增強(qiáng)RAW264.7的細(xì)胞增殖和吞噬活性[23]，促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-12等細(xì)胞因子的分泌以及上調(diào)細(xì)胞中iNOS的mRNA表達(dá)水平，并且在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯的濃度依賴關(guān)系。以上結(jié)果說明EXGFP-A可以通過多途徑激活RAW264.7細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫活性。

多糖的糖組成和糖苷鍵類型對生物活性有一定的影響[24]，EXGFP-A主要由α-D-葡萄吡喃糖組成，這可能與其免疫活性有著密切的關(guān)系。本文的研究結(jié)果證實(shí)了灰樹花多糖EXGFP-A是一種以葡萄糖為主的吡喃型中性多糖，并具有一定的體外免疫活性，為多糖的結(jié)構(gòu)與活性的研究提供了理論依據(jù)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Structure and immunomodulatory activity of extracellular polysaccharide from Grifola frondosa

Lirong Han, Dai Cheng, Lirui Wang, and Chunling Wang
College of Food Engineering and Biological Technology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China

Abstract:We aimed at analyzing the structure of extracellular polysaccharide A from Grifola frondosa (EXGFP-A) and testing its immunomodulatory activity. Structural analysis shows that EXGFP-A was a contained α-D-glucoside bond and pyranose ring. GC analysis reveals that EXGFP-A was mainly composed of rhamnose, arabinose, xylose, mannose, glucose, galactose, by the molar ratio of 0.28:0.31:0.30:0.06:7.98:0.61. The results of MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay indicates when EXGFP-A was at a concentration of 80 μg/mL and treatment time of 48 h, RAW264.7 cells proliferation index reached a maximum of 137.5%. Meanwhile, the AO staining showed that EXGFP-A activated RAW264.7 cells and improved the level of intracellular nucleic acid metabolism. In addition, in a certain range of concentration, EXGFP-A was able to increase the release of NO in RAW264.7 cells, and upregulate the mRNA expression of immunological factor TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ and iNOS of RAW264.7 cells. Our results confirm that EXGFP-A had immunomodulatory activity. Our findings provided scientific basis for the structural analysis and application of Grifola frondosa polysaccharide.

Keywords:Grifola frondosa polysaccharide, structural analysis, RAW264.7 cells, immunomodulatory activity

Corresponding author:Chunling Wang. Fax/Tel: +86-22-60912421; E-mail: wangchunling@tust.edu.cn