賈艷艷，殷月蘭，談衛(wèi)軍，段斐斐，潘志明，陳祥，焦新安

揚州大學 江蘇省人獸共患病重點實驗室 江蘇省動物重要疫病和人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009

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減毒李斯特菌載體運送HPV16 E7基因重組疫苗的構建及其生物學特性

賈艷艷，殷月蘭，談衛(wèi)軍，段斐斐，潘志明，陳祥，焦新安

揚州大學 江蘇省人獸共患病重點實驗室 江蘇省動物重要疫病和人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009

賈艷艷, 殷月蘭, 談衛(wèi)軍, 等. 減毒李斯特菌載體運送HPV16 E7基因重組疫苗的構建及其生物學特性. 生物工程學報, 2016, 32(5): 683–692.

Jia YY, Yin YL, Tan WJ, et al. Construction and characterization of an attenuated recombinant Listeria monocytogenes vector vaccine delivering HPV16 E7. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 683–692.

摘 要:單核細胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes, LM) 是一種理想的腫瘤疫苗載體，本文旨在構建表達人乳頭瘤狀病毒 (HPV) 16型 E7蛋白的減毒重組李斯特菌疫苗候選株并分析其生物學特性。利用同源重組技術將HPV16 E7基因定點整合至LM hly基因信號肽序列下游，獲得減毒重組李斯特菌LM4△hly::E7，并對該重組菌進行生物學特性研究。實驗結果表明，重組菌能夠分泌表達具有免疫學活性的E7-LLO融合蛋白，大小約66 kDa；通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到重組菌能夠在RAW264.7細胞胞內(nèi)增殖。ELISA測定結果顯示減毒重組菌能夠誘導小鼠產(chǎn)生E7特異性抗體。重組菌在C57BL/6小鼠中LD50為3.863×109CFU，低于親本株4個數(shù)量級，通過組織切片觀察到重組菌對小鼠肝臟及脾臟無明顯病理變化。以上表明，本研究構建的分泌表達E7-LLO融合蛋白的減毒重組李斯特菌具有較好的安全性，為下一步研究其抗腫瘤作用提供了材料，并為研發(fā)宮頸癌的免疫治療型候選疫苗奠定重要基礎。

關鍵詞:減毒單核細胞增生李斯特菌，人乳頭瘤狀病毒16型 E7蛋白，巨噬細胞系，安全性

Received: September 29, 2015; Accepted: December 21, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31472193, 31101841), Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

國家自然科學基金 (Nos. 31472193, 31101841)，江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程項目資助。

宮頸癌位居女性癌癥死亡率中的第2位，是重要的公共健康問題[1]。中國是宮頸癌的高發(fā)國之一，每年有13.5萬人被診斷為宮頸癌，占全世界每年宮頸癌病例的1/3[2-3]。目前已經(jīng)證實人乳頭瘤狀病毒 (HPV) 是引起宮頸癌的主要病原，而HPV的E6、E7蛋白特異性存在于癌細胞中，是維持細胞轉(zhuǎn)化和惡性特征所必需的，常被作為宮頸癌免疫治療的靶基因[4-5]。

單核細胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes, LM) 是一種革蘭氏陽性、兼性胞內(nèi)寄生菌[6]，一般經(jīng)過消化道感染，然后通過腸上皮細胞散播至全身[7]。LM被吞噬細胞吞噬后，在吞噬體內(nèi)LM分泌毒力因子溶血素 (Listeriolysin O, LLO) 及磷脂酶C裂解吞噬體膜，進而逃脫至細胞胞漿。這種獨特胞內(nèi)生活史使LM能夠誘導強烈的CD8+T細胞免疫和CD4+T細胞免疫應答[8]。目前，利用LM誘導強烈的T細胞免疫應答特性，李斯特菌已試用于傳染性疾病和腫瘤疾病疫苗載體的研發(fā)[9-11]。

基于此，本研究擬以LM4為材料，利用穿梭載體pKSV7將HPV16 E7抗原定點整合至LM4的基因組hly基因信號肽序列下游，獲得分泌表達LLO-E7融合蛋白的重組減毒李斯特菌，并對其生物學特性進行研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要菌株及載體

野生型菌株LM4 (血清型1/2a) 及LM4△hly::esat-6，RAW264.7細胞、宿主菌E. coli DH5α、穿梭載體pKSV7 (Ampr) 及pNF8 (ermr，gfp-mut1)、GST-E7融合蛋白均由江蘇省人獸共患病學重點試驗室保存；pcDNA3.1-E7由揚州大學醫(yī)學院高慧老師惠贈；pMD 18-T載體購自TaKaRa公司。

1.1.2主要儀器

普通搖床SCS 24購自上海市離心機械研究所；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海躍進醫(yī)療器械廠；PCR儀購自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；臺式冷凍小離心機FRESCO 21購自Thermo公司；超聲波裂解儀購自SONICS & MATERIALS公司；蛋白質(zhì)電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司；轉(zhuǎn)印儀購自Amer Sham公司；Biophotometer分光光度計、臺式冷凍離心機Centrifuge 5810R購自eppendorf公司。

1.1.3主要試劑

細菌基因組DNA抽提純化試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DNA回收試劑盒及限制性核酸內(nèi)切酶、DNA Marker、X-Gal及IPTG購自大連寶生物 (TaKaRa) 公司；T4 DNA連接酶購自Promega公司；氨芐青霉素 (Amp)、氯霉素購自華美公司；BHI 培養(yǎng)基 (BactoTMbrain heart infusion) 購自BD公司；過硫酸銨 (AP)、Tris、十二烷基磺酸鈉 (SDS)、三氯乙酸 (TCA) 購自上海國藥集團；羊抗鼠IgG-HRP購自Sigma公司及HPV16 E7鼠單克隆抗體 (clone 8C9) 購自Invitrogen公司。

1.1.4實驗動物

6周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心。

1.2引物設計

參照GenBank上公布的基因序列設計引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3重組菌LM4△hly::E7的構建

1.3.1hly a、hly b及HPV16 E7基因的PCR擴增及拼接

參照細菌基因組抽提試劑盒說明抽提LM4基因組DNA，以LM4基因組DNA為模板，分別擴增上下游同源臂hly a及hly b；以pcDNA3.1-E7為模板，擴增E7片段。

表1　實驗所用引物Table 1 Primer pairs used to amplify related genes

利用重疊延伸PCR (SOEing PCR) 將hly a、E7及hly b拼接成a-E7-b，按照DNA凝膠回收試劑盒程序回收a-E7-b片段，連接至pMD18-T載體，鑒定正確的pMD18-T-aEb克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.3.2pKSV7-aEb的構建

pMD18-T-aEb及pKSV7經(jīng)過KpnⅠ、XbaⅠ雙酶切消化后，分別回收酶切產(chǎn)物，置16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，抽提重組質(zhì)粒pKSV7-aEb，酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒用于重組李斯特菌的構建。

1.3.3電轉(zhuǎn)化

用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒pKSV7-aEb導入感受態(tài)LM4中，通過溫度和氯霉素抗性壓力下實現(xiàn)同源重組，最終將目的抗原E7定點整合至LM4的hly啟動子下游，同時實現(xiàn)hly毒力區(qū)42 bp片段的缺失[12]，獲得在氯霉素抗性下不能生長且經(jīng)PCR及RT-PCR鑒定正確的重組菌LM4△hly::E7。

1.4Western blotting分析

采用TCA方法提取重組菌分泌蛋白，將分泌蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)印至NC膜，1% BSA的PBST溶液封閉過夜，次日，與HPV16 E7鼠單克隆抗體在37 ℃孵育2?3 h，然后用HRP標記的羊抗鼠IgG二抗孵育1 h，ECL顯色。

1.5重組菌LM4△hly::E7在巨噬細胞中的增殖

將pNF8 (ermr，gfp-mut1) 電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)LM4△hly::E7，構建表達GFP的重組菌LM4△hly::E7 (pNF8)。參照殷月蘭等的方法[13]，將LM4△hly::E7 (pNF8) 以MOI為20∶1 (細菌數(shù)∶細胞數(shù))感染RAW264.7巨噬細胞；取培養(yǎng)3 h和5 h后的細胞爬片進行固定、鬼壁環(huán)肽染色，最終利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察LM4△hly::E7 (pNF8) 在巨噬細胞中的侵襲與增殖情況。

1.6生長曲線的測定

將LM4、LM4△hly::E7接種于BHI培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)12?14 h，然后取1 mL菌液用PBS洗滌2次，取適當體積菌液接種至5 mL BHI培養(yǎng)基中調(diào)整OD600值至0.05，放置在37 ℃振搖培養(yǎng)，分別在0 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6.5 h、8 h、9.5 h、10.5 h及22.5 h等時間點后取出2支菌液，測定其OD600值，繪制其生長曲線。

1.7溶血活性的測定

LM4、LM4△hly::E7在BHI培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)15 h后，菌液離心后取上清，用PBS調(diào)整OD600至相同大小，取70 μL上清液加至96孔V型板中，用PBS從原液到27系列倍比稀釋，然后每孔加入30 μL 1%綿羊紅細胞，微振蕩混勻，96孔V型板放置37 ℃培養(yǎng)箱，1 h后觀察溶血情況。

1.8重組菌對C57BL/6小鼠的LD50測定

將過夜培養(yǎng)物按1∶20轉(zhuǎn)接BHI培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 h后，用PBS洗滌，測定其OD600并調(diào)整至所需大小。將6周齡C57BL/6小鼠隨機分成5組，每組5只，腹腔注射，每只小鼠注射劑量為100 μL，呈倍數(shù)遞減。觀察2周，記錄小鼠死亡情況，并采用Reed-Muench方法計算重組菌對C57BL/6小鼠的半數(shù)致死量[14]。

1.9免疫鼠臟器的組織切片觀察

6?8周齡 C57BL/6雌性小鼠，隨機分為2組，每組3只，在0 d、7 d，分別腹腔注射LM4△hly::E7、LM4 (注射劑量為0.1 LD50) 和PBS，于2次免疫后7 d取小鼠的脾臟、肝臟用13%甲醛固定，用于組織切片的制作，分析組織的顯微變化。

1.10ELISA檢測免疫鼠血清中的E7特異性抗體

免疫后7 d，無菌采集分離小鼠血清以GST-E7融合蛋白為檢測抗原，應用間接ELISA方法測定免疫組的E7抗體效價。

1.11數(shù)據(jù)分析

應用SPSS16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析及卡方檢驗；應用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。

2　結果與分析

2.1重組菌LM4△hly::E7的構建

2.1.1hlya-E7-b片段的PCR擴增

采用PCR擴增出hly a、hly b、HPV16 E7 等3個基因片段，電泳結果顯示產(chǎn)物大小分別為525 bp、291 bp及730 bp，與預期結果相符合。通過2次SOEing PCR擴增，將hly a、E7、hly b拼接成hlya-E-b，電泳結果顯示PCR產(chǎn)物大小為1 586 bp，與預期相符。

2.1.2pKSV7-hlya-E-b的構建及鑒定

將hlya-E-b拼接片段連接至pMD-18T載體，將鑒定正確的重組質(zhì)粒pMD-18T-aEb與pKSV7經(jīng)過KpnⅠ、XbaⅠ雙酶切消化后，連接轉(zhuǎn)化。抽提重組質(zhì)粒，進行PCR鑒定，電泳結果顯示出PCR產(chǎn)物為1 586 bp，然后經(jīng)過雙酶切鑒定，產(chǎn)物呈現(xiàn)出6 900 bp和1 586 bp兩條帶，與預期相符 (圖1)，說明重組質(zhì)粒構建成功，命名為pKSV7-hlya-E-b。

2.1.3重組菌LM4△hly::E7的鑒定及Western blotting分析

圖1　重組質(zhì)粒pKSV7-hlya-E-b的PCR鑒定及酶切鑒定Fig. 1 Identification results of pKSV7-hlya-E-b using PCR and enzyme digestion assay. M: λ-T14; Lane 1: pKSV7-hly a-E-b digested with KpnⅠ and XbaⅠ; Lane 2: PCR product of pKSV7-hly a-E-b.

圖2　LM4△hly::E7的PCR鑒定Fig. 2 PCR identification results of LM4△hly::E7 (primer hly a1/hly b+). M: DL2 000. 1: amplified product of LM4△hly::E7; 2: amplified product of wild type LM4; 3: amplified product of pKSV7-hly aEb.

將重組質(zhì)粒pKSV7-hlya-E-b電轉(zhuǎn)化至LM4感受態(tài)中，經(jīng)過同源重組將E7片段定點整合至hly的啟動子下游得到重組菌，然后利用hly a上游引物與hly b下游區(qū)外側(cè)設計的一條引物hlyb+進行PCR擴增，鑒定結果顯示重組菌的擴增片段為1 700 bp，親本株LM4的擴增片段為1 450 bp，pKSV7-hlya-E-b無任何擴增片段，且經(jīng)測序證明，與LM4的擴增片段相比，重組菌的1 700 bp擴增片段中增加了E7基因序列，少了42 bp的hly毒力區(qū)，由此說明減毒重組菌構建成功并命名為LM4△hly::E7。

提取重組菌LM4△hly::E7的分泌蛋白進行Western blotting分析，結果顯示利用HPV16 E7單抗檢測到在66 kDa左右處有一條清晰的濃染帶，與預期相符 (圖3)，表明LM4△hly::E7能夠分泌表達具有良好免疫反應性的HPV16 E7蛋白。

2.2重組菌LM4△hly::E7 (pNF8) 在巨噬細胞中的增殖試驗

為了檢測重組菌LM4△hly::E7在巨噬細胞中的增殖情況，構建了表達GFP的重組菌LM4△hly::E7 (pNF8)，LM4△hly::E7 (pNF8) 感染RAW264.7細胞后，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到感染3 h時，RAW264.7細胞胞內(nèi)有少量的發(fā)綠色熒光重組菌，而感染5 h時胞內(nèi)出現(xiàn)了大量綠色熒光的重組菌 (圖4)。

圖3　LM4△hly::E7的Western blotting分析Fig. 3 Western blotting analysis of proteins secreted by LM4△hly::E7. M: protein marker; 1: LM4△hly::E7; 2: wt LM4.

圖4　LM4△hly::E7(pNF8)在巨噬細胞RAW264.7中的增殖Fig. 4 Intracellular localization of LM4△hly::E7(pNF8) strain in RAW264.7 cells (1 000×).

2.3重組菌LM4△hly::E7的生長曲線測定

LM4△hly::E7、LM4的生長曲線見圖5，從圖中可以看出LM4△hly::E7與LM4的生長曲線基本一致，均表現(xiàn)為培養(yǎng)1 h至7 h期間，細菌進入快速增長期，7–9 h時，細菌增殖進入穩(wěn)定期。

2.4重組菌LM4△hly::E7的溶血性試驗

通過溶血性實驗，顯示出重組菌LM4△hly::E7的溶血效價為23，野生型細菌LM4的溶血效價為24(圖6)，表明E7插入LM4 的hly下游并未導致LLO的完全失活。

圖5　重組菌LM4△hly::E7的生長曲線Fig. 5 Growth curve of LM4△hly::E7 strain.

圖6　溶血性試驗Fig. 6 Haemolytic activities of LM4 and LM4△hly::E7 strains.

2.5重組菌LM4△hly::E7的LD50測定

小鼠死亡情況見表2，通過Reed-Muench法計算重組菌LM4△hly::E7的LD50為3.863×109CFU，而LM4的LD50為1.06×105CFU，結果顯示重組菌LM4△hly::E7的LD50高于野生菌LM4的4個數(shù)量級。

2.6組織切片觀察結果

通過組織切片觀察到LM4腹腔感染小鼠的肝臟呈現(xiàn)肝細胞腫脹，水泡變性，肝竇狹窄甚至閉塞，細胞漿有大小不等的水泡；脾臟結構模糊，巨噬細胞浸潤。重組菌LM4△hly::E7以高于LM4 105倍的細菌量感染小鼠后，小鼠肝臟僅表現(xiàn)出輕微的炎癥反應，少量炎性細胞浸潤，脾臟無明顯病理變化 (圖7)。

2.7血清中E7抗體檢測結果

利用ELISA方法檢測各免疫組小鼠血清中E7抗體水平，圖8顯示LM4△hly::E7免疫組小鼠血清中E7抗體效價為1∶400，試驗結果表明構建的重組李斯特菌能夠誘導機體產(chǎn)生E7特異性的體液免疫應答。

3　討論

表2　LM菌株對C57BL/6小鼠的LD50測定Table 2 LD50of LM strains for C57BL/6 mice

圖7　不同免疫組的脾臟及肝臟組織切片F(xiàn)ig. 7 Spleen and liver tissue sections from mice in different groups (400×).

圖8　不同免疫組血清中的E7抗體水平Fig. 8 Serum antibodies against E7 antigen in different regimens.

目前，重組李斯特菌疫苗用于癌癥免疫治療成為眾學者的研究方向之一[15-17]，其采用的構建方式多數(shù)是應用質(zhì)?；パa系統(tǒng)[18-20]，構建的重組菌需要抗生素的維持，并存在質(zhì)粒被脫掉的隱患。因此，本研究利用穿梭載體pKSV7通過同源重組技術將HPV16 E7抗原整合至LM4基因組內(nèi)，在無壓力條件下傳代脫掉質(zhì)粒，進行篩選重組菌時，首先選擇在BHI平板生長，而在BHIcm+不生長的細菌，然后在hly b下游區(qū)的外側(cè)設計一條引物，通過PCR擴增鑒定外源抗原是否整合至基因組及質(zhì)粒是否完全脫掉，最終獲得穩(wěn)定分泌表達HPV16 E7抗原的重組菌株，該減毒重組菌不需要抗生素的維持，安全性好，在臨床應用上更有優(yōu)勢。

LLO是一類膽固醇依賴的孔形成素，單增李斯特菌的重要毒力蛋白[21]，是維持LM逃脫吞噬體進入胞漿及誘導MHCⅠ類抗原提呈途徑所必需的[22-23]。同時研究表明，LLO蛋白能夠增強腫瘤抗原的免疫原性，增加腫瘤特異性CD8+T細胞產(chǎn)生的數(shù)量，有助于疫苗以CD8+T細胞免疫應答方式消除腫瘤，在腫瘤疫苗研發(fā)中具有很好的佐劑效應[24-25]。因此，在構建重組李斯特菌時，將E7基因定點插入至hly基因的信號肽下游，以期獲得分泌表達E7-LLO融合蛋白的重組菌，提取減毒重組菌的分泌型蛋白進行Western blotting分析，結果顯示減毒重組菌能夠分泌表達具有免疫學活性的E7-LLO蛋白，為減毒重組菌發(fā)揮抗腫瘤作用奠定重要基礎。

考慮到疫苗的安全性，我們在構建重組菌的同時，缺失了LLO部分毒力區(qū)，LD50測定結果顯示重組菌的毒力比親本株LM4顯著下降，且通過組織切片觀察到重組菌對小鼠肝臟及脾臟無明顯病理變化，安全性較高。而溶血性試驗表明E7的插入及LLO部分毒力區(qū)的缺失并未導致LM4△hly::E7中LLO活性的完全喪失，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到重組菌能夠在RAW264.7細胞內(nèi)增殖，這為重組菌誘導CD8+T細胞免疫應答奠定基礎。

生長曲線測定結果顯示重組菌和野生型細菌無顯著差別，表明外源抗原E7插入LM4基因組內(nèi)，沒有造成細菌的代謝負擔，也沒有改變細菌的正常生長規(guī)律。此外，對重組菌進行連續(xù)傳代，利用RT-PCR技術能夠檢測到第30代重組菌中E7的表達 (另文發(fā)表)，表明該重組菌具有較好的遺傳穩(wěn)定性。同時血清抗體檢測結果顯示構建的減毒重組李斯特菌能夠誘導小鼠產(chǎn)生E7特異性的體液免疫應答。

本研究成功地構建了表達E7蛋白的減毒重組李斯特菌，并對其溶血活性、毒力及體液免疫應答等特性進行了分析，結果顯示該減毒重組菌分泌表達具有良好免疫學活性的E7-LLO融合蛋白，毒力比親本株顯著降低，安全性好，且能夠誘導特異性抗體的產(chǎn)生，這為后續(xù)抗腫瘤研究提供了重要的生物材料，為宮頸癌候選疫苗的研發(fā)提供了新思路。

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(本文責編 陳宏宇)

生物技術與方法

Construction and characterization of an attenuated recombinant Listeria monocytogenes vector vaccine delivering HPV16 E7

Yanyan Jia, Yuelan Yin, Weijun Tan, Feifei Duan, Zhiming Pan, Xiang Chen, and Xin′an Jiao
Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses, Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Abstract:Listeria monocytogenes (L. monocytogenes, LM) is an excellent tumor vaccine vector. In this study, recombinant LM vaccine candidate expressing human papillomavirus type 16 (HPV16) E7 protein was constructed and its charactericts were determined. Through homologous recombination, E7 gene was cloned in frame with the LM4 Phly promoter-signal sequence, and introduced into the chromosome of LM4. The recombinant strain named LM4△hly::E7 with the plasmid-free and antibiotic-resistant gene-free was constructed. LM4△hly::E7 could express and secrete E7-LLO fusion protein; its size is 66 kDa and has immunological activity. Furthermore, LM4△hly::E7 could multiply in RAW264.7 macrophages by confocal laser scanning microscope. Additionally, LM4△hly::E7 could induce specific antibodies against E7 in immunized mice in ELISA. Also, the 50% lethal dose (LD50) of LM4△hly::E7 strain was 3.863×109CFU (Colony-Forming Units) in C57BL/6 mice with intraperitoneal immunization, which was more attenuated than wild type LM4. Mice immunized with LM4△hly::E7 did not show obvious pathological change. These data show that LM4△hly::E7 expressing E7-LLO fusion protein has good safety, which may provide the materials for research of antitumor effect and would be a promising vaccine candidate for cervical cancer.

Keywords:attenuated Listeria monocytogenes, HPV16 E7, macrophage cell line, safety

Corresponding author:Xin′an Jiao. Tel: +86-514-87971136; Fax: +86-514-87311374; E-mail: jiao@yzu.edu.cn