繆小輝　夏錫儀　呂鏜烽　宋　勇　莊志方

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 常州市武進(jìn)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,江蘇　常州　213000)

血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1在肺癌中表達(dá)及與轉(zhuǎn)移的關(guān)系

繆小輝夏錫儀呂鏜烽1宋勇1莊志方

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 常州市武進(jìn)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,江蘇常州213000)

〔摘要〕目的探討血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(PECAM)1在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中表達(dá)及其與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法建立穩(wěn)轉(zhuǎn)PECAM1的A549細(xì)胞，加入抗PECAM1抗體抑制后，觀察A549細(xì)胞生長(zhǎng)。通過免疫組化方法檢測(cè)105例NSCLC及10例肺良性病變的組織切片中PECAM1蛋白水平，分析PECAM1與患者肺癌的轉(zhuǎn)移及愈后關(guān)系。結(jié)果加入抗PECAM1抗體，A549擴(kuò)增抑制明顯。NSCLC組織中，PECAM1表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于肺良性病變組織(χ2=8.980，P=0.003)。PECAM1表達(dá)與肺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性(P=0.023)。PECAM1表達(dá)與患者無(wú)疾病生存期(PFS)及總生存期(OS)存在一定相關(guān)性(P=0.002，0.016)。結(jié)論在非小細(xì)胞肺癌中，PECAM1是患者肺癌轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志。

〔關(guān)鍵詞〕血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1;肺癌;轉(zhuǎn)移;預(yù)后

肺癌的局部侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制仍未完全明確。血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(PECAM)1參與調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及新生血管形成。在肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制中，是否通過VE-鈣黏蛋白(VE-cadherin)和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(PECAM)組成信號(hào)復(fù)合物而激活內(nèi)皮細(xì)胞的整合素，本研究通過臨床標(biāo)本檢測(cè)，明確PECAM1在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)轉(zhuǎn)移中的作用。

1材料與方法

1.1標(biāo)本腫瘤組織切片由常州市武進(jìn)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科以及南京軍區(qū)南京總醫(yī)院呼吸內(nèi)科提供，2006年1月至2014年1月收集的腫瘤組105例原發(fā)性NSCLC的腫瘤組織為實(shí)驗(yàn)組及10例對(duì)照組良性病變肺組織(肺結(jié)核1例、炎性假瘤1例、肺大皰3例、支氣管擴(kuò)張5例)的手術(shù)標(biāo)本，手術(shù)前期均未經(jīng)化學(xué)治療及放射治療。腫瘤組織學(xué)分期(TNM分期)基于國(guó)際癌癥聯(lián)盟(UICC)2009版分類法分期。其中實(shí)驗(yàn)組包括60例腺癌和45例鱗癌。本研究得到常州市醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法采用A549細(xì)胞株(ATCC細(xì)胞庫(kù)提供CCL-185)。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PECAM1的肺癌細(xì)胞株。加入抗人PECAM1單克隆抗體(E0458 Santa Cruz公司)，觀察A549細(xì)胞株生長(zhǎng)狀況。采用常用免疫組織化學(xué)染色(Envision)的方法，組織切片經(jīng)常規(guī)程序給予脫蠟和復(fù)水。兔抗人PECAM1單克隆抗體(E0458 Santa Cruz公司)首先經(jīng)抗體稀釋液磷酸鹽緩沖液(PBS)按1∶100稀釋，加入組織切片中，孵化過夜。經(jīng)PBS液沖洗后，加入山羊抗兔二抗體(丹麥Dako公司)，繼續(xù)孵育30 min。再次經(jīng)PBS液沖洗后，組織切片經(jīng)雙色顯示劑(DAB顯色劑)孵化30 min。經(jīng)蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片。按評(píng)分系統(tǒng)(Remmele)，選取5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。計(jì)算PECAM1細(xì)胞質(zhì)染色的程度(陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色)。按陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%為(-)，5%～25%為(+)，25%～50%為()，≥50%為()。<25%(-～+)為低表達(dá)組，≥25%(～)為高表達(dá)組。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)組從接受手術(shù)日期開始隨訪，至患者死亡日期結(jié)束隨訪，2015年6月1日仍然生存或無(wú)疾病進(jìn)展生存的按60個(gè)月計(jì)算(生存者隨訪<60個(gè)月不納入實(shí)驗(yàn)組)。采用SPSS19.0軟件行χ2檢驗(yàn)及Kaplan-Meire生存分析。

2結(jié)果

2.1穩(wěn)轉(zhuǎn)PECAM1的A549細(xì)胞生長(zhǎng)狀況構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PECAM1的A549細(xì)胞，A549細(xì)胞擴(kuò)增明顯。在加入抗PECAM1抗體后，A549細(xì)胞擴(kuò)增明顯抑制。見圖1。

2.2兩組PECAM1的表達(dá)根據(jù)免疫組化染色顯示，PECAM1定位于組織細(xì)胞的細(xì)胞膜中，表達(dá)程度如PECAM1陰性表達(dá)的肺良性病變組織(圖2A)，低表達(dá)組肺腺癌(+，圖2B)及肺鱗狀細(xì)胞癌PECAM1高表達(dá)組(，圖2C)。

實(shí)驗(yàn)組中PECAM1表達(dá)陽(yáng)性68例(64.76%)，對(duì)照組僅為1例(10.00%)，兩組差異顯著(χ2=8.980，P=0.003)。

2.3PECAM1在NSCLC組織中的表達(dá)及其與臨床特征的關(guān)系PECAM1表達(dá)與臨床特征無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

2.4PECAM1表達(dá)與NSCLC患者的無(wú)疾病進(jìn)展生存期(PFS)及總生存期(OS)關(guān)系至隨訪結(jié)束時(shí)，肺癌患者的生存人數(shù)為31例(29.52%)。無(wú)肺癌疾病進(jìn)展生存人數(shù)為19例。腫瘤組織中PECAM1陽(yáng)性表達(dá)與患者的PFS及OS存在相關(guān)(χ2=19.795，P=0.001；χ2=10.318，P=0.016)，見表2。整體肺癌術(shù)后患者的PFS中位時(shí)間為18個(gè)月(95%CI11.127～24.513)，OS中位時(shí)間為33個(gè)月(95%CI22.136～49.535)。PECAM1表達(dá)陰性組中，PFS中位時(shí)間為33個(gè)月(95%CI13.428～53.572)，OS中位時(shí)間為43個(gè)月(95%CI39.275～52.049)；PECAM1表達(dá)陽(yáng)性組中，PFS中位時(shí)間為11個(gè)月(95%CI9.634～14.328)，OS中位時(shí)間為27個(gè)月(95%CI17.316～28.094)。PECAM1陰性組的PFS和OS中位時(shí)間明顯長(zhǎng)于陽(yáng)性組。PECAM1表達(dá)陽(yáng)性組PFS顯著低于陰性組(χ2=19.795，P=0.001圖3)，同樣兩組的OS存在顯著差異(χ2=10.318，P=0.016 圖3)，PECAM1陽(yáng)性組預(yù)后明顯差于陰性組。

A：A549細(xì)胞株;B：穩(wěn)轉(zhuǎn)PECAM1的A549細(xì)胞;C：抗PECAM1抗體抑制后的A549細(xì)胞圖1　穩(wěn)轉(zhuǎn)PECAM1的A549細(xì)胞

A：PECAM1在肺良性病變(肺大皰)組織中陰性表達(dá);B：PECAM1在肺腺癌組織中低表達(dá);C：PECAM1在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)圖2　PECAM1在NSCLC以及良性病變組織中的表達(dá)

圖3　PECAM1與NSCLC患者預(yù)后相關(guān)的Kaplan-Meier生存曲線

指標(biāo)nPECAM1陽(yáng)性表達(dá)χ2值P值性別 男6643(65.15)0.0120.913 女3925(64.10)年齡(歲) <604525(55.56)2.9250.087 ≥606043(71.67)吸煙4935(71.43)腫瘤大小(cm) ≤33119(61.29)0.0000.992 >37449(66.22)組織形態(tài) 鱗癌4526(57.78)0.2320.630 腺癌6042(70.00)N分期 N06134(55.74)5.1950.023 N1～34434(77.27)TNM分期 Ⅰ+Ⅱ7549(65.33)0.0380.846 Ⅲ+Ⅳ3019(63.33)分級(jí) 高/中分化5836(62.07)0.4120.521 低分化4732(68.09)

表2　PECAM1與患者PFS及OS的關(guān)系〔n(%)〕

3討論

肺癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但目前認(rèn)為，吸煙和空氣污染是肺癌發(fā)生的主要社會(huì)環(huán)境因素，戒煙和改善生存環(huán)境是降低肺癌發(fā)生的主要手段。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者死亡的重要原因，依據(jù)目前診斷和治療方法，肺癌早期診斷率低，病死率高。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者治療失敗的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的過程，它包括了腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲并穿過腫瘤基質(zhì)，通過內(nèi)滲或外滲穿過血管以及最終在遠(yuǎn)處某器官的積聚〔1〕。腫瘤細(xì)胞的侵襲能力是導(dǎo)致腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的首要因素。腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用影響著腫瘤的轉(zhuǎn)移，腫瘤轉(zhuǎn)移能夠成功的一個(gè)關(guān)鍵是腫瘤新生血管的形成〔2〕。

PECAM1又稱CD31，分子量約130 kD，是一種細(xì)胞膜表面蛋白。正常表達(dá)于白細(xì)胞、血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞〔3〕。PECAM1參與細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞增殖及擴(kuò)散，其中包括血管的生成、血管滲透和血液循環(huán)外的白細(xì)胞募集〔4〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PECAM1在多種腫瘤的轉(zhuǎn)移中起著重要作用〔5〕。PECAM1在腫瘤侵襲中的作用逐漸被研究者重視。PECAM1被認(rèn)為與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白參與細(xì)胞黏附及遷移的調(diào)控及促進(jìn)腫瘤的新生血管生成。

在多種腫瘤組織中，如胰島管腺癌，肝癌等，發(fā)現(xiàn)PECAM1過表達(dá)〔6,7〕。卵巢癌研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)PECAM1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和存活能力〔8,9〕，故認(rèn)為PECAM1水平可能與腫瘤的惡性程度成正相關(guān)?，F(xiàn)今，PECAM1作為一個(gè)可能的腫瘤治療的靶點(diǎn)及惡性度預(yù)測(cè)因子已越來越為腫瘤研究者矚目。PECAM1調(diào)節(jié)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及新生血管形成的作用機(jī)制到目前為止只有初步探索。筆者構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PECAM1的A549細(xì)胞，A549細(xì)胞擴(kuò)增明顯。在加入抗PECAM1抗體后，A549細(xì)胞擴(kuò)增明顯抑制。PECAM1調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。整合素主要參與構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架跨膜復(fù)合體，可誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排，增強(qiáng)細(xì)胞間的機(jī)械聯(lián)系，雙向轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)，廣泛影響細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。PECAM1通過參與整合素調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲〔10,11〕，目前機(jī)制未明確。本研究證實(shí)PECAM1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，PECAM1表達(dá)陽(yáng)性患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能。另外，PECAM1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，促使肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，最終影響患者的生存期。

4參考文獻(xiàn)

1Liu GQ，Aaron TP，Chen ZL，etal.ICAM-1-activated Src and eNOS signaling increase endothelial cell surface PECAM-1 adhesivity and neutrophil transmigration〔J〕.Blood,2012；120(9)：1942-52.

2Horace DeL，Liu Y，Pierre-Yves De，etal.Vascular endothelial platelet endothelial cell adhesion molecule 1(PECAM-1)regulates advanced metastatic progression〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2010；107(43)：18616-21.

3Ma L，Kenneth CP.CD31 exhibits multiple roles in regulating T lymphocyte trafficking in vivo〔J〕.J Immunol,2012；189(8)：4104-11.

4Jamie RP.Relative contribution of PECAM-1 adhesion and signaling to the maintenance of vascular integrity〔J〕.J Cell Sci,2011；124(9)：1477-85.

5Ann-Marie C，Madhura N，Colin F，etal.Collaborative enhancement of antibody binding to distinct PECAM-1 epitopes modulates endothelial targeting〔J〕.J Cell Biol PLoS One,2012；7(4)：e34958.

6Yao S，Zhang J，Chen H，etal.Diagnostic value of immunohistochemical staining of GP73，GPC3，DCP，CD34，CD31，and reticulin staining in hepatocellular carcinoma〔J〕.J Histochem Cytochem,2013；61(9)：639-48.

7Kuang BH，Wen XZ，Ding Y，etal.The prognostic value of platelet endothelial cell adhesion molecule-1 in non-small-cell lung cancer patients〔J〕.Med Oncol,2013；30(2)：536.

8Tachezy M，Reichelt U，Melenberg T，etal.Angiogenesis index CD105(endoglin)/CD31(PECAM-1)as a predictive factor for invasion and proliferation in intraductal papillary mucinous neoplasm(IPMN)of the pancreas〔J〕.Histol Histopathol,2010；25(10)：1239-46.

9Kim OH，Kang GH，Noh H，etal.Proangiogenic TIE2(+)/CD31(+)macrophages are the predominant population of tumor-associated macrophages infiltrating metastatic lymph nodes〔J〕.Mol Cells,2013；36(5)：432-8.

10Eleni T，Mohamed Irani-T，William B，etal.A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress〔J〕.Nature,2005；437(7057):426-31.

11Desgrosellier JS，Cheresh DA.Integrins in cancer：biological implications and therapeutic opportunities〔J〕.Nat Rev Cancer,2010；10(1)：9-22.

〔2016-01-10修回〕

(編輯曲莉)

基金項(xiàng)目：江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)科技發(fā)展基金(JLY20120033)資助

通訊作者：莊志方(1967-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事肺部疾病的診治研究。

〔中圖分類號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)10-2411-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.045

1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院南京軍區(qū)南京總醫(yī)院呼吸內(nèi)科

第一作者：繆小輝(1971-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事呼吸及戒煙-慢阻肺方面的研究。