李志永　李　玲　李麗瑋　侯建明　甄艷君

(保定市徐水區(qū)人民醫(yī)院病理科，河北　保定　072550)

木賊有效部位抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及LOX-1、NOX4mRNA的表達(dá)

李志永李玲1李麗瑋2侯建明3甄艷君3

(保定市徐水區(qū)人民醫(yī)院病理科，河北保定072550)

〔摘要〕目的探討木賊有效部位對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-ECV304)凋亡抑制作用的可能機(jī)制。方法體外ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，用木賊有效部位進(jìn)行干預(yù)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞血凝素樣ox-LDL受體1(LOX-1)mRNA、NADPH氧化酶4(NOX4)mRNA及 Caspase-3 mRNA表達(dá)。結(jié)果與模型組比較木賊有效部位干預(yù)后細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)，LOX-1 mRNA、NOX4mRNA及 Caspase-3 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論木賊有效部位可能通過抑制LOX-1 mRNA及 NOX4 mRNA的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)凋亡相關(guān)基因的調(diào)控來減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

〔關(guān)鍵詞〕木賊；有效部位；氧化低密度脂蛋白；內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡；血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1；NADPH氧化酶

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)起始于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔1〕。而內(nèi)皮細(xì)胞過度凋亡則是血管內(nèi)皮損傷的一種重要形式，被認(rèn)為是AS的始動(dòng)步驟〔2〕。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作為主要凋亡誘導(dǎo)因素之一，在AS的發(fā)病中起了關(guān)鍵作用。血凝素樣ox-LDL受體1(LOX-1)是新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞膜上的ox-LDL特異性受體，介導(dǎo)ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的病理學(xué)作用，NADPH氧化酶(NOX)是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的主要酶體，研究證實(shí)LOX-1與NADPH氧化酶在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及凋亡過程中起重要作用，兩者均與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3,4〕。課題組在離體及在體實(shí)驗(yàn)均證實(shí)中草藥木賊提取物具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞(EC)凋亡和調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)等多層面機(jī)制保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，并初步判定木賊有效藥理活性部位為黃酮及芬酸類化合物〔5,6〕。但其抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的具體途徑仍不清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察木賊有效部位干預(yù)ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)凋亡和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1 mRNA及NOX4 mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討木賊有效部位抗凋亡的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Revco)，756MC型紫外-可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，Gen Amp5700型PCR儀(美國(guó)PE公司)，F(xiàn)R-200A凝膠掃描系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)，微量移液器(美國(guó)Eppendorf)，Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀(美國(guó)B-C公司)，木賊飲片(購(gòu)于石家莊市樂仁堂大藥房,經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥系鑒定)，槲皮素和阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)0080-9705，0773-9910)，D101型大孔樹脂(天津大均科技開發(fā)有限公司)，HUVEC-ECV304(武漢大學(xué)中國(guó)動(dòng)植物保存中心)，新生小牛血清(四季青公司)，DMEM培養(yǎng)液及胰酶(GIBCO公司)，總RNA提取試劑(TRIzol)、cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒及DNA Marker(均為北京TIANGEN公司)，PCR引物(北京三博遠(yuǎn)志生物公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2木賊有效部位的制備稱取適量木賊飲片置于圓底燒瓶中，加12倍量的70%的乙醇浸泡2 h，電熱套加熱回流提取3次，每次2 h，過濾并合并濾液，得木賊提取液。稱取大孔樹脂40 g，將提取液上樹脂柱，先以水沖至洗脫液近無色后(Molish反應(yīng)陰性)分別用蒸餾水，30%乙醇，70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液作為測(cè)試樣品，分別以槲皮素和阿魏酸為對(duì)照品用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)此樣品中總黃酮和總酚酸含量并測(cè)定其純度。將70%乙醇洗脫液減壓濃縮后，用無血清培養(yǎng)基DMEM將樣品稀釋，以二甲基亞砜(DMSO)使其充分溶解，此為用于本實(shí)驗(yàn)的木賊有效部位。

1.3ox-LDL的制備采用沉淀法參照文獻(xiàn)〔7〕制備。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與分組采用15%新生小牛血清DMEM作為培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中瓶養(yǎng)HUVEC-ECV304。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞15瓶，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 h后隨機(jī)分成3組①對(duì)照組：無血清DMEM培養(yǎng)液；②模型組：無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h后加入ox-LDL，使其終濃度為80 μg/ml；③木賊有效部位組(有效部位組)：無血清DMEM培養(yǎng)液中加入木賊有效部位，使其終濃度為50 μg/ml，培養(yǎng)1 h后加入ox-LDL，使其終濃度為80 μg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞和培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率用胰酶消化收獲細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，1 500 r/min離心5 min棄上清，細(xì)胞用70%冷乙醇固定，置于-20℃保存待測(cè)。碘化丙啶(PI)染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率。

1.6RT-PCR按Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總mRNA，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，每一樣品均出現(xiàn)清晰的28 S和18 S條帶,且28 S條帶的亮度和寬度約為18 S條帶的2倍，純度鑒定A260/A280值為1.8～2.0。RNA的反轉(zhuǎn)錄過程及擴(kuò)增過程分別按試劑盒說明書進(jìn)行。LOX-1引物序列為：上游5′-TGGGAAAAGAGCCAAGAGAA-3′，下游5′-TGCAGCCAGCTAAATGACAG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)229 bp；NOX4引物序列為：上游5′-CTCAGCGGAATCAATCAGCTGTG-3′，下游5′-AGAGGAACACGACAATCAGCCTTA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)286 bp；Caspase-3引物序列為：上游5′-ATACTCCTTCCATCAAATAG-3′，下游5′-AACATCACAAAACCATAATC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)411 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列為：上游5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物全長(zhǎng)300 bp。LOX-1反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，51.8℃退火40 s，72℃延伸50 s；NOX4反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s；Caspase-3反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，47℃退火60 s，72℃延伸60 s；GAPDH反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s；以上均30個(gè)循環(huán)后再72℃延伸5 min。取10 μl反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠(含EB)上電泳，F(xiàn)R-980生物電泳圖像分析軟件分析灰度值，以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH條帶的灰度比值代表目的基因mRNA的表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS15.0軟件行單因素方差分析，S-N-Kq檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示：模型組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。加入木賊有效部位后細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05)。見表1。

2.2LOX-1、NOX4及Caspase-3 mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較模型組LOX-1 mRNA、NOX4 mRNA及Caspase-3 mRNA的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比有效部位組LOX-1 mRNA、NOX4 mRNA及Caspase-3 mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。見表1及圖1。

表1　木賊有效部位對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率及LOX-1、NOX4及

與對(duì)照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

1～3:對(duì)照組；模型組；有效部位組圖1　各組細(xì)胞LOX-1、NOX4及Caspase-3 mRNA RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖

3討論

木賊中含有黃酮類及芬酸類化合物〔8〕，這兩類物質(zhì)具有抗炎、抗氧化，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制AS形成的作用。本課題組在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上將木賊有效部位提取的方法加以改進(jìn)得到含黃酮及芬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的提取物，經(jīng)離體實(shí)驗(yàn)得到與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)果，證實(shí)黃酮及芬酸是木賊抗AS的有效部位之一。

LOX-1是ox-LDL特異性受體，主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面，在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)ox-LDL結(jié)合、內(nèi)吞、降解，及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能障礙等過程中起關(guān)鍵作用〔3〕。LOX-1在ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中表達(dá)上調(diào)并介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抗LOX-1抗體則抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡〔9〕。本實(shí)驗(yàn)表明木賊有效部位可能是通過下調(diào)LOX-1 mRNA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的。NOX是一種過氧化物酶，其催化產(chǎn)物活性氧參與機(jī)體防御和信號(hào)傳導(dǎo)等許多生理過程。內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)NOX4。NOX在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中起了重要作用，它可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生而參與細(xì)胞凋亡〔9,10〕。研究表明〔11〕ox-LDL與LOX-1結(jié)合后，可激活細(xì)胞膜上的NOX，導(dǎo)致活性氧表達(dá)增加。抑制LOX-1能顯著降低內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧的生成及凋亡的發(fā)生〔9〕。本實(shí)驗(yàn)顯示木賊有效部位可下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1 mRNA的表達(dá)，推測(cè)木賊有效部位應(yīng)使NOX4 mRNA的表達(dá)下降，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)加入木賊有效部位后NOX4 mRNA表達(dá)受到明顯抑制，表明NOX4 mRNA表達(dá)的下降是受LOX-1介導(dǎo)的，這顯示木賊有效部位抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與抑制LOX-1-NOX4途徑密切相關(guān)。

Chen等〔12〕報(bào)道ox-LDL通過LOX-1下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，激活Caspase-3誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。最近有研究〔13〕發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的可能途徑為：LOX-1通過激活NOX使活性氧產(chǎn)生增加，后者使p38MAPK磷酸化并激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，而NF-κB可調(diào)控Caspase-3及 Bcl-2基因的表達(dá)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。Caspase家族是多種途徑發(fā)生凋亡的關(guān)鍵酶，而Caspase-3是凋亡發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，本研究中ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3 mRNA表達(dá)升高，木賊有效部位能減少Caspase-3 mRNA表達(dá)。研究曾證實(shí)木賊有效部位可使ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)升高，Bax/Bcl-2比值明顯降低〔6〕。故推測(cè)木賊有效部位可能是通過抑制LOX-1及NOX4來達(dá)到調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)的。

綜上所述，木賊有效部位抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡途徑之一可能是通過下調(diào)LOX-1表達(dá)來抑制NOX4激活，進(jìn)而通過調(diào)控Caspase-3 mRNA表達(dá)減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

通訊作者：甄艷君(1952-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥防治動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)研究。

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)10-2343-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.013

1保定市徐水區(qū)人民醫(yī)院皮膚科2邢臺(tái)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)二科

3河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)課教學(xué)部

第一作者：李志永(1974-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事中藥防治動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)研究。