錢源　劉君　李曉紅　馬忠蕊　王艷梅　肖雪　郭知　張?zhí)m　屈在卿

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷室，云南 昆明　650032)

昆明地區(qū)妊娠糖尿病孕婦網(wǎng)膜下脂肪的全基因組甲基化差異研究

錢源劉君李曉紅馬忠蕊王艷梅肖雪郭知張?zhí)m屈在卿

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷室，云南 昆明650032)

【摘要】目的本研究應用甲基化芯片技術研究妊娠糖尿病網(wǎng)膜下脂肪與正常對照組的全基因組甲基化差異，提供妊娠期糖尿病網(wǎng)膜下脂肪全基因組范圍內的甲基化差異數(shù)據(jù)背景，為尋找妊娠糖尿病網(wǎng)膜脂肪基因表達差異原因提供線索。方法收集3例通過OGTT實驗確診但未經(jīng)過治療的妊娠期糖尿病患者和同期3例年齡，孕次產(chǎn)次，孕前BMI與之無差異的健康對照者網(wǎng)膜下脂肪組織，提取總RNA后，采用Illumina Methylation BeadChipchip芯片進行檢測，并進行基因甲基化結果進行比較，尋找具有甲基化差異的基因。結果結果發(fā)現(xiàn)兩研究組中網(wǎng)膜下脂肪的全基因組DNA甲基化存在差異。妊娠糖尿病組中總共有1298個基因發(fā)生了低甲基化，1570個基因發(fā)生了高甲基化。這些基因參與了細胞骨架構建，細胞凋亡調控，細胞核內信號轉導，糖和脂代謝，炎癥反應等。進一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，兩組樣本在miRNA啟動區(qū)上位點甲基化變化水平不一致的基因有3個，包括：PSORS1C1，PCDHB13和DKFZp686A1627。在同一CpG島區(qū)域位點甲基化變化水平不一致的基因有7個，在miRNA區(qū)域具有甲基化差異的基因有13個。結論正常對照組與GDM組中基因的甲基化位點和水平存在顯著差異，這可能與該基因在組織中表達的蛋白水平在兩組中的差異表達密切相關。是否甲基化的差異是導致相應基因表達水平差異的原因還需要深入的研究。未來需要進一步弄清DNA甲基化在網(wǎng)膜下脂肪中對基因表達目標蛋白的調控作用，為妊娠糖尿病的治療和預防提供線索。

【關鍵詞】妊娠期糖尿?。患谆V；全基因組；網(wǎng)膜下脂肪組織

妊娠糖尿病(GDM)的病因涉及遺傳、環(huán)境、疾病等諸多方面，其發(fā)病機制也相當復雜，到目前為止，還沒有完全揭示清楚。GDM是由基因和環(huán)境相互作用引起的代謝紊亂，主要特點是胰島素抵抗。胰島素抵抗的本質就是單位胰島素的生物效應的降低，即胰島素刺激葡萄糖利用能力的降低。最初，可以通過代償性增加胰島素分泌，產(chǎn)生高胰島素血癥，維持血糖水平正常。當這一過程發(fā)展到超過機體代償極限，則表現(xiàn)為糖尿病。

與皮下組織不同，網(wǎng)膜下組織在解剖學上擁有更豐富的血流和神經(jīng)分布，它表達更高的受體和具有更活躍的細胞代謝活性，使其對人體交感神經(jīng)系統(tǒng)敏感，分泌更多的脂肪因子和輸出更多的游離的脂肪酸，導致其與代謝相關疾病的關聯(lián)性更高[1-9]。

大量經(jīng)典遺傳學手段已經(jīng)證明，不同的個體在GDM易感性上存在差異，但是單純從基因變異的角度是無法完整解釋妊娠糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在脂肪組織生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，DNA甲基化，特別是啟動子區(qū)域的甲基化可以調控脂肪細胞分化轉錄因子，轉錄輔助因子以及很多脂肪組織特異性基因的表達[10-12]。糖尿病患者通過長期飲食控制和運動會使得胰島素抵抗的情況得到改善。這些證據(jù)都支持DNA甲基化的異常非?？赡苁菍е氯焉锾悄虿“l(fā)生的重要原因，同時，也可能成為改善或者治療妊娠糖尿病的突破口。

因此，本研究應用甲基化芯片技術研究妊娠糖尿病網(wǎng)膜下脂肪與正常對照組網(wǎng)膜下脂肪的全基因組甲基化水平，比對和分析正常對照組與GDM組中基因的甲基化位點和水平的差異，提供了妊娠期糖尿病網(wǎng)膜下脂肪全基因組范圍內的甲基化差異數(shù)據(jù)背景，為尋找妊娠糖尿病網(wǎng)膜脂肪基因表達差異原因提供線索。

1資料與方法

1.1一般資料本次研究對象為2012年1月至2014年5月在昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診定期產(chǎn)前檢查并入院分娩的孕婦。在知情同意的前提下，選取3位妊娠期糖尿病孕婦為病例組(GDM組)，選取同期的3位正常孕婦為對照組(NGT組)。

1.1.1GDM的納入標準既往無高血壓、糖尿病以及心、肝、腎疾病以及自身免疫性疾病，并符合75g OGTT的妊娠糖尿病診斷標準。

1.1.2NGT的納入標準既往以及妊娠期無高血壓，糖尿病以及心，肝，腎疾病和自身免疫性疾病。75gOGTT試驗正常。

入選本研究的孕婦均無重大疾病家族史，且在年齡，身高，體質量和孕周等方面無明顯差異。病例均為單病種病例，除本文提及的疾病外未發(fā)現(xiàn)其他疾病。

1.2方法

1.2.1樣本采集在剖宮產(chǎn)術中迅速剝離大網(wǎng)膜脂肪，大小約為0.5cm×0.5cm×0.5cm，立即存儲于RNALater中，凍存于-80℃超低溫冰箱中。

1.2.2采用 Illumina Methylation BeadChip芯片進行檢測甲基化檢測將基因組DNA亞硫酸鹽處理，變性和擴增后，用隨機內切酶酶切擴增產(chǎn)物。再將這些DNA片段與Methylation BeadChip芯片進行雜交，通過芯片上的特異性捕獲探針與相互補的酶切基因片段結合，雜交過夜，清洗后進行單堿基延伸和染色。根據(jù)只有與gDNA發(fā)生互補結合的探針才能得到延伸，染色后掃描。

1.2.3數(shù)據(jù)分析將掃描得到的原始數(shù)據(jù)，通過GenomeStudio 軟件，根據(jù)Methylation Analysis Algorithms 生成每個樣本每個位點的甲基化水平，經(jīng)過偏差校正和位點過濾，得到甲基化水平結果。兩組樣本進行配對的甲基化分析，篩選差異甲基化位點的標準為：adjustP<0.05，Beta 差異值≥0.2。

2結果

對妊娠糖尿病組和正常對照組的網(wǎng)膜下脂肪進行全基因組甲基化水平檢測，比對并分析兩組樣本組中網(wǎng)膜下脂肪的全基因組DNA甲基化差異。結果發(fā)現(xiàn)總共有1298個基因發(fā)生了低甲基化，1570個基因發(fā)生了高甲基化。

進一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，兩組樣本在miRNA啟動區(qū)上位點甲基化變化水平不一致的基因有3個，包括PSORS1C1、PCDHB13和DKFZp686A1627。在同一CpG島區(qū)域位點甲基化變化水平不一致的基因有7個，在miRNA區(qū)域具有甲基化差異的基因有13個。具體基因列表見表1～3。

表1　在miRNA啟動區(qū)上位點甲基化變化水平不一致的結果列表

表2　 在同一CpG島區(qū)域位點甲基化變化水平不一致結果表

表3　在miRNA區(qū)域具有甲基化差異的位點

3討論

本研究比對并分析兩研究組中網(wǎng)膜下脂肪的全基因組DNA甲基化差異，結果發(fā)現(xiàn)總共有1298個基因發(fā)生了低甲基化，1570個基因發(fā)生了高甲基化。這些基因參與了細胞骨架構建、細胞凋亡調控、細胞核內信號轉導、糖和脂代謝、炎癥反應等。

在表1中，兩組樣本組中miRNA啟動區(qū)上位點甲基化變化水平具有差異的基因包括：PSORS1C1、PCDHB13和DKFZp686A1627。PSORS1C1又稱為SEEK1，位于染色體6p21.3上HLA-C基因座的終端，兩個基因呈緊密連鎖。Cheung YH等[13]報道PSORS1C1可能和TCF19、POU5F1、CCHCR1等是1型糖尿病潛在的關聯(lián)致病基因。PCDHB13編碼原鈣黏附蛋白β13，這個基因是原鈣黏附β基因簇的一員，定位在5號染色體上。該蛋白由一個外顯子編碼，在特異的細胞對細胞的神經(jīng)連接中起到重要的作用。DKFZp686A1627又名為PHF2P1，是一個假基因。

表2中，在同一CpG島區(qū)域位點甲基化變化水平不一致的基因包括：PFKP、GSTT1、ZFYVE28、PCDHB、RNF39、HLA-C、HLA-DRB。其中，PFKP基因又名為PFKF、PFK-C、PFK-P或者 ATP-PFK，定位在10號染色體上。該基因編碼PFKP蛋白酶，主要在糖代謝中不可逆的催化6磷酸果糖成為1,6雙磷酸果糖，在糖酵解中發(fā)揮重要作用[14,15]。Morgan AR等[16]報道過PFKP的基因變異與SGA的發(fā)生密切相關。GSTs(谷胱甘肽-S-轉移酶)是人體內一類具有重要解毒作用的多基因酶族。GSTs催化各種親電子致癌物與谷胱甘肽反應。其中GST-θ同工酶由GSTT1基因編碼，分別對多環(huán)芳烴類和鹵代烷烴類具有很強的解毒作用[17,18]。RNF39又稱為HZF，HZFW， LIRF。該基因存在于6號染色體MHC I基因區(qū)域內中間，HLA-J的前面。該基因編碼的蛋白在小鼠功能實驗中表明在神經(jīng)突觸可塑性中起到非常重要的作用。人類白細胞抗原(HLA)基因位于第6對染色體短臂上，為一組密切連鎖的基因群。Ⅰ類基因區(qū)域包括HLA-A、HLA-B、HLA-C和其他一些功能未明的基因及假基因，其編碼的抗原分子存在于全部有核細胞的表面，負責遞呈外來抗原給CD8+的T淋巴細胞；Ⅱ類基因區(qū)域主要包括HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP3個亞區(qū)，分別編碼DR、DQ和DP抗原，存在于成熟B淋巴細胞及抗原遞呈細胞表面，負責遞呈抗原給CD4+細胞。HLA通過主要組織相溶性復合體(MHC)限制，參與T淋巴細胞識別抗原和其他免疫細胞的相互作用，以及自身耐受的形成和維持，在識別自身和異己、誘導和調節(jié)免疫反應等多個方面均具有重要作用。研究支持HLA與糖尿病的發(fā)生有強烈的相關性[19]。

表3中，在miRNA區(qū)域具有甲基化差異位點的基因包括：MSLN、ATP2B2、MIR886、MIR202、MIR1228、MIR346、MIR886、MIR526A1、MIR548N、MIR654、MIR886和MIR300。其中，MSLN稱為間皮素，是一種分子量為40KDa的細胞表面糖蛋白，高表達于多種腫瘤組織中，一些研究表明，特殊信號途徑的激活在腫瘤間皮素表達增加中起重要作用[20]。ATP2B2稱為鈣離子轉運ATP酶B2。ATP酶能將三磷酸腺苷(ATP)催化水解為二磷酸腺苷(ADP)和磷酸根離子的酶，是一個釋放能量的反應。小鼠動物模型中的研究支持ATP2B2的變異與聽力丟失和運動平衡密切相關[21]。Hu CC等[22]報道C20orf166-AS1在前列腺癌組織中具有顯著性差異表達，推測其可能是前列腺癌的特異lncRNAs。研究支持MiR-886-3p 在人骨髓細胞中下調SDF1的表達[23]。Mir346作用于RIP140蛋白的5'非轉錄區(qū)，上調RIP140蛋白的表達。受體相互作用蛋白140(receptor-interacting protein 140, RIP140)是一種轉錄輔抑制因子，其與核受體結合后能夠負向調節(jié)多種代謝組織中靶基因的轉錄，包括脂肪組織、肌肉組織以及肝臟等?；虺聊琑IP140后，多種代謝途徑相關基因表達上調，主要涉及糖酵解、甘油三酯合成、三羧酸循環(huán)、脂肪酸β氧化、線粒體電子傳遞以及氧化磷酸化等能量代謝過程[24]。RIP140有望成為治療代謝綜合征的候選靶點。He J等[25]認為MiR300可能在調節(jié)細胞應對輻射時參與了調節(jié)細胞凋亡，細胞周期以及DNA損傷和修復的信號通路。

綜上，本研究支持正常對照組與GDM組中基因的甲基化位點和水平存在顯著差異，這可能與該基因在組織中表達的蛋白水平在兩組中的差異表達密切相關。是否甲基化的差異是導致相應基因表達水平差異的原因還需要深入的研究。未來需要進一步弄清DNA甲基化在網(wǎng)膜下脂肪中對基因表達目標蛋白的調控作用，為妊娠糖尿病的治療和預防提供線索。

參 考 文 獻

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編輯：宋文穎

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【Abstract】ObjectiveIn order to investigate the pathogenesis of gestational diabetes mellitus (GDM), the differences of genes methylation patterns in omenta adipose tissues between pregnant women with GDM and the normal pregnancies were compared.These data provided the background of methylation patterns in whole genome, which could provide the clues for explaining the discrepancy of gene expression between the two study groups. Method3 cases of omenta adipose tissues in insulin untreated GDM pregnancies diagnosed by oral glucose tolerance test (OGTT) were collected. Meanwhile, the same cases of omenta adipose tissues in normal pregnancies were collected. There was no discrepancy between the two groups , including gestation age, parity and pre-pregnancy BMI. The RNAs of these tissues were extracted, and the gene methylation of these tissues were detected by Illumina Methylation BeadChipchip. The differences of gene expression profiles between GDM and normal controls were analyzed in order to find the possible disease genes. ResultsThere was discrepancy of mathylation pattern in whole genome between the two groups. 1298 genes were hypomethylated and 1570 genes were hypermethylated in GDM group. These genes were involved in many physiological functions such as: cytoskeleton conformation, cell apoptosis, ignal transduction,fat and sugar metabolism and inflammation. Futher data supported that there were different methylation patterns in three genes, PSORS1C1，PCDHB13and DKFZp686A1627. There were seven genes with different methylation patterns in the same CpG island regions, thirteen genes with diggerent methylation patterns in miRNA regions.ConclusionsThere are notable CpG methylation differences in omental adipose tissues between GDM and the normal pregnancie, which would be closely relatively with the expression difference of target genes. Whether the discrepancy of methylation pattern was the lead course of the exprssion were needed for further research. The mechanisms of gene methylation on target protein should be elucidated, which could provide the clues for prevention and treatment of GDM.

【Key words】GDM； methylation profile； genome； OVAT

DOI:10.13470/j.cnki.cjpd.2016.01.001

基金項目：云南省科技廳-昆明醫(yī)學院應用基礎研究聯(lián)合專項資金項目(2012FB039)；國家自然科學基金(81360103)

*通訊作者：錢源，E-mail：yuanqian2x@hotmail.com

【中圖分類號】R714.256

【文獻標識碼】A

(收稿日期：2015-07-01)