蔡學(xué)杰，高玉琪，李曉燕，陳英劍，梁　春，吳宗貴

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丹參多酚酸鹽對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈壁細(xì)胞清道夫受體A和CD36 mRNA表達(dá)的影響

蔡學(xué)杰，高玉琪＊，李曉燕，陳英劍，梁春，吳宗貴

[摘要]目的觀察中藥丹參多酚酸鹽對(duì)ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈壁血管細(xì)胞清道夫受體A和CD36 mRNA表達(dá)的影響，探討丹參多酚酸鹽抗動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用機(jī)制。方法30只AopE基因敲除小鼠（4周齡，雄性）隨機(jī)分成4組，即模型組（腹腔注射生理鹽水，7只）、丹參多酚酸鹽60mg/kg組（7只）、丹參多酚酸鹽120mg/ kg組（8只）、丹參多酚酸鹽240mg/kg組（8只），正常對(duì)照組（C57BL/6J野生型小鼠）6只。高脂飲食喂養(yǎng)于24周末時(shí)處死各組動(dòng)物，取主動(dòng)脈根部連續(xù)切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，觀察血管壁形態(tài)和脂質(zhì)沉積情況，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)主動(dòng)脈血管壁細(xì)胞清道夫受體A和CD36 mRNA表達(dá)進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果ApoE基因敲除鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)均可見明顯的SR-A和CD36mRNA表達(dá)，C57BL/6J小鼠正常血管內(nèi)僅見少量表達(dá)；丹參多酚酸鹽（240mg/kg組）干預(yù)后，與模型組比較，ApoE基因敲除鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)CD36 mRNA表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而SR-A mRNA的表達(dá)未見明顯減少（P＞0.05）。結(jié)論中藥丹參多酚酸鹽抗ApoE-/-鼠主動(dòng)脈粥樣硬化可能與其下調(diào)CD36mRNA表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞的形成有關(guān)，而與SR-A無關(guān)。

[關(guān)鍵詞]丹參多酚酸鹽；ApoE基因敲除小鼠；清道夫受體；動(dòng)脈粥樣硬化

清道夫受體（scarvenger，SR）是一類結(jié)構(gòu)多樣化的糖蛋白受體家族，主要分布在巨噬細(xì)胞膜上。目前研究發(fā)現(xiàn)，清道夫受體與動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[1]，其中，清道夫受體A（SR-A）和清道夫受體B類中的CD36是吞噬氧化修飾的低密度脂蛋白，形成泡沫細(xì)胞的主要受體[2]。由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)存在大量激活的巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬氧化性脂蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞是AS斑塊形成的特征性改變和始動(dòng)環(huán)節(jié)，因此將SR-A和CD36作為AS斑塊作用靶點(diǎn)的研究，目前成為一熱點(diǎn)。丹參多酚酸鹽（salvianolate，sal）是從傳統(tǒng)中藥丹參中采用現(xiàn)代科學(xué)工藝技術(shù)提取的水溶性有效成分，具有活血化瘀、抗氧化和抗氧自由基的作用[3]，與AS的關(guān)系密切。本研究用RT-PCR方法觀察丹參多酚酸鹽對(duì)C57BL/6J ApoE基因敲除小鼠AS斑塊內(nèi)SR-A和CD36 mRNA表達(dá)的影響，來深入探討丹參多酚酸鹽抗AS進(jìn)展的作用機(jī)制，為丹參多酚酸鹽抗AS提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與分組、主動(dòng)脈AS模型的建立及給藥方法雄性4周齡C57BL/6J AopE基因敲除小鼠32只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后給予高脂飲食（含2％膽固醇和5％的豬油，其余為普通飼料），繼續(xù)喂養(yǎng)4周，隨機(jī)處死2只，取主動(dòng)脈根部，HE染色普通光鏡下觀察，確定已形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊后，將其余30只ApoE基因敲除小鼠隨機(jī)分成4組，即模型組（僅腹腔注射生理鹽水，7只）、丹參多酚酸鹽60mg/kg組（7只）、丹參多酚酸鹽120mg/kg組（8只）、丹參多酚酸鹽240mg/kg組（8只），正常對(duì)照組（即C57BL/6J野生型小鼠6只）。應(yīng)用上海綠谷制藥有限公司生產(chǎn)的中藥注射粉針劑：注射用丹參多酚酸鹽100mg，溶于0.9％的氯化鈉溶液10 ml中，按以上分組劑量給予丹參多酚酸鹽腹腔注射，每周5次，繼續(xù)喂養(yǎng)至24周。24周末時(shí)模型組、丹參多酚酸鹽60mg/kg組、丹參多酚酸鹽120mg/kg組、丹參多酚酸鹽240mg/kg組和正常對(duì)照組分別死亡1只、1只、2只、2只、1只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2動(dòng)物處死和主動(dòng)脈標(biāo)本采集于實(shí)驗(yàn)24周末取血后處死動(dòng)物，取出主動(dòng)脈，切取主動(dòng)脈根部1cm；其余血管標(biāo)本立即置于液氮中保存；部分標(biāo)本于4％多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定后，常規(guī)石蠟包埋，做病理切片用。

1.3RT-PCR法檢測(cè)各組SR-A和CD36mRNA表達(dá)[4]稱取主動(dòng)脈血管組織50mg，至玻璃勻漿器，加入TRIzol（Gibco BRL提取總mRNA試劑盒）1 ml，充分混勻并靜置后，吸出上清液置于EP離心管內(nèi)，按試劑盒說明書提取總mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄（Gibco BRL逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）。分別取2μl cDNARNA為模板，各加入SR-A和CD36引物（終濃度均為1μmmol/L）進(jìn)行PCR（總體積均為30μl）。SR-A和CD36引物序列和產(chǎn)物長度分別為：SR-A：上游5'-TAGGCACTT GGGATGTCTGA-3，下游5'-GTCCTCA ATTTGTATT GGT GCT -3'，854 bp；CD36：上游5'-TGCTGGAGCTGTTATTGGTG-3'，下游5'-AC AAACCTCCGTAAGAGTAC-3′，343 bp。PCR條件為：30℃變性10min，50℃退火30min，99℃延伸5min，共40個(gè)循環(huán)后50℃延伸5min。同時(shí)分別取2μl cDNA-RNA為模板，加入β-actin引物（終濃度均為1μmmol/L）：上游5'-AACAGT CCGCCTA GAAG CAC-3'，下游5'-CGT TGACAT CCG TAA AGACC -3'，281 bp。PCR條件為：95℃變性5min，95℃退火10min，57℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)后84℃延伸5min。擴(kuò)增后行1.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物分子量確定其是否為欲擴(kuò)增的片段。利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，用圖像分析儀以Quantity one軟件進(jìn)行分析，測(cè)定電泳帶的平均吸光度值，計(jì)算SR-A、CD36分別與β-actin電泳帶的平均吸光度比值，分別表示SR-A和CD36mRNA水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及方法應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1主動(dòng)脈AS模型的病理改變C57BL/6J野生型小鼠飼養(yǎng)過程中死亡1只，喂食高脂飲食后，血管內(nèi)膜光滑，未見動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成；ApoE基因敲除鼠飼養(yǎng)過程中共死亡6只，高脂飼養(yǎng)12周后，均出現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化，粥樣斑塊內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶，內(nèi)膜增厚，斑塊體積大。C57BL/6J野生型小鼠血管壁內(nèi)，血管內(nèi)膜光滑，無動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。丹參多酚酸鹽240mg/kg組干預(yù)后動(dòng)脈粥樣斑塊較小，AS減輕。如圖1。

圖1　主動(dòng)脈AS模型的病理改變（HE×100）

2.2丹參多酚酸鹽對(duì)各組SR-A mRNA和CD36m RNA表達(dá)的影響ApoE基因敲除小鼠AS斑塊內(nèi)可見明顯的854 bp和343 bp片斷，為SR-A和CD36mRNA表達(dá)，C57BL/6J小鼠正常血管內(nèi)僅見少量表達(dá)，說明AS斑塊血管能大量表達(dá)SR-A mRNA 和CD36mRNA，而正常血管壁表達(dá)SR-A mRNA和CD36mRNA量較少。丹參多酚酸鹽（60mg/kg組）和丹參多酚酸鹽（120mg/kg組），ApoE基因敲除鼠AS斑塊內(nèi)CD36 mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較，無明顯變化；丹參多酚酸鹽（240mg/kg組）處理后，ApoE基因敲除鼠AS斑塊內(nèi)CD36 mRNA表達(dá)明顯減少，而丹參多酚酸鹽各組SR-A mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較未見明顯減少，說明丹參多酚酸鹽能夠下調(diào)AS斑塊內(nèi)CD36mRNA表達(dá)，而不影響SR-A mRNA的表達(dá)。見圖2、3和表1、2。

圖2　丹參多酚酸鹽對(duì)各組巨噬細(xì)胞SR-A mRNA的作用

圖3　丹參多酚酸鹽對(duì)各組巨噬細(xì)胞CD36 mRNA的作用

表1　丹參多酚酸鹽對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊SR-A mRNA/β-actin mRNA比較（x±s）

表2　丹參多酚酸鹽對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊CD36 mRNA/β-actin mRNA比值比較（x±s）

3　討論

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，是多種因素共同作用的結(jié)果。通過清道夫受體吞噬變性低密度脂蛋白，形成泡沫細(xì)胞以及堆積造成血管壁上的脂質(zhì)紋理，是AS形成早期的重要特征。其中SR-A和CD36是吞噬變性ox-LDL，形成泡沫細(xì)胞的主要受體。SR-A是巨噬細(xì)胞上識(shí)別ox-LDL，ac-LDL的特異性受體，Tsukamoto等發(fā)現(xiàn)SR-A在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中高度表達(dá)，并且其配體ox-LDL也存在于斑塊中[5]，修飾的LDL 于SR-A結(jié)合導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)的堆積，并且SR-A對(duì)LDL的攝取是無限制的，最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成，甚至斑塊破裂，而SR-A活性降低可減弱這一過程。CD36在體內(nèi)的配基相當(dāng)廣泛，參與多種生理過程，它是巨噬細(xì)胞表面主要的識(shí)別、內(nèi)吞氧化ox-LDL的SR，參與了動(dòng)脈粥樣硬化形成。Nakata等[6]通過尸檢發(fā)現(xiàn)的胸主動(dòng)脈AS斑塊，脂質(zhì)條紋，泡沫細(xì)胞都有CD36表達(dá)；免疫組化顯示CD36和SR-A在AS斑塊的不同部位表達(dá)不同，CD36陽性巨噬細(xì)胞-泡沫細(xì)胞主要分布在粥樣硬化斑塊核，而SR-A主要分布在斑塊核外圍，這種表達(dá)分布的不同，特別是富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞與CD36陽性巨噬細(xì)胞分布的一致提示了CD36在攝取ox-LDL，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈血管損傷處有SR-A的表達(dá)，并隨著斑塊的進(jìn)展SR-A表達(dá)量逐漸增多。Nakagawatoyama等于1995年報(bào)道用對(duì)比分析法分析人AS病變上CD36與SR-A的表達(dá)，結(jié)果顯示SR-A表達(dá)在動(dòng)脈管腔附近，而CD36則在粥樣斑塊的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞附近有高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與SR-A不同，CD36識(shí)別的是OX-LDL中磷脂，而SR-A識(shí)別的是OX-LDL中的載脂蛋白部分[7，8]。

ApoE基因敲除鼠動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)CD36及ApoE基因雙敲除小鼠，高脂餐喂養(yǎng)12周動(dòng)脈損傷較ApoE基因敲除小鼠減少70％以上[9]，繼續(xù)觀察20 及35周后，這種保護(hù)作用仍然存在[10]。進(jìn)一步在此模型基礎(chǔ)上，采用致死量放療和干細(xì)胞移植的方法，觀察到只缺乏巨噬細(xì)胞CD36表達(dá)可以明顯減少AS的形成，主動(dòng)脈樹斑塊面積減少88. 1％，由此可見巨噬細(xì)胞CD36缺失起到更主要的作用[11]。CD36的特異性配體EP80317可以減輕ApoE基因敲除小鼠AS損傷的形成[12]。上述均提示CD36在促進(jìn)AS形成中的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)ApoE基因敲除鼠AS斑塊內(nèi)可見泡沫細(xì)胞聚集，呈圓形或橢圓形。ApoE基因敲除小鼠AS斑塊內(nèi)可見明顯的854 bp和343 bp片斷，為SR-A和CD36 mRNA表達(dá)，C57BL/6J小鼠正常血管內(nèi)僅見少量表達(dá)，說明AS斑塊血管能大量表達(dá)SR-A mRNA和CD36 mRNA，而正常血管壁表達(dá)SR-A mRNA和CD36 mRNA量較少。丹參多酚酸鹽（240mg/kg組）處理后，ApoE基因敲除鼠AS斑塊內(nèi)CD36 mRNA表達(dá)明顯減少，而SR-A mRNA表達(dá)未見明顯減少，說明丹參多酚酸鹽能夠下調(diào)AS斑塊內(nèi)CD36 mRNA表達(dá)，而不影響SR-A mRNA的表達(dá)，提示丹參多酚酸鹽可能主要通過下調(diào)AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL的主要受體CD36 mRNA的表達(dá)，來減少核心部分的脂質(zhì)堆積，尤其是膽固醇的沉積，減少泡沫細(xì)胞形成，而斑塊破裂與其所含的膽固醇量有關(guān)，從而起到穩(wěn)定斑塊的作用，阻止動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)一步發(fā)展，此可能是丹參多酚酸鹽在分子水平抗AS的作用機(jī)制之一。

丹參多酚酸鹽下調(diào)CD36表達(dá)的調(diào)控機(jī)制如何，目前尚不清楚，有報(bào)道ox-LDL被CD36識(shí)別，內(nèi)吞入巨噬細(xì)胞后，部分酯鏈被切割產(chǎn)生9-HODE （hydroxyoctadecadienoic acid 9），13 -HODE（hy -droxyoc-tadecadienoic acid 13）等產(chǎn)物，它們作為過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）的配基激活PPARγ，進(jìn)而使CD36的轉(zhuǎn)錄合成增加，增加的CD36則識(shí)別攝入更多ox-LDL，這就是CD36對(duì)ox-LDL攝取的正反饋機(jī)制假說[13]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ox-LDL的主要成分CHOOE、LDL過氧化的主要產(chǎn)物HNE，分別通過PPARα和Nrf2上調(diào)CD36的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[14]。筆者推測(cè)丹參多酚酸鹽可能影響上述調(diào)控過程中的PPARγ和Nrf2，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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[2015-11-18收稿，2015-12-15修回]

[本文編輯：張鴻瑫]

藥學(xué)

The effects of salvianolate on ApoE -knockout mice's aortic wall cell SR -A and CD36 mRNA expression

CAI Xue-jie①，GAO Yü-qi，LI Xiao-yan，et al.①Department of Cardiology，Chinese PLA No. 456 Hospical，Jinan，Shandong 250031，China

[Abstract]Objective To observe the effects of salvianolate on Apo E-knockout mice's aortic wall cell SR-A and CD36 mRNA expression，and to explore the mechanism of salvianolate's anti-atherosclerotic progress. Methods The 30 AopE knockout mice（4 weeks old，male）were randomly divided into 4 groups，namely，the model group（normal saline，7mice），salvianolate 60mg/kg group（7 mice），salvianolate 120mg/kg group（8 mice），salvianolate 240mg/kg group（8 mice），normal control group（C57BL/6J wild-type mice，6）. The each group of mice were killed after 24 weeks' high-fat diet. The aortic root serial sections were taken for routine hematoxy iineosin staining and observing vessel wall morphology and lipid deposition；reverse transcription polymerase chain reaction was used to analyse scavenger receptor A and CD36 mRNA expression on the aorta vascular wall cell in qualitative and quantitative analysis. Results The clear expression of SR-A and CD36mRNA in ApoE knockout mice atherosclerotic plaques were visible，in C57BL/6J mice with normal blood vessels only a small amount of expression was seen；After the intervention of Salvianolate（240mg/kg group），CD36 mRNA expression in ApoE knockout mice's atherosclerotic plaque was significantly reduced compared with model group. The difference was statistically significant（P＜0.05），while there was no significant decrease in the SR no-A mRNA expression（P＞0.05）. ConclusionThe anti -atherosclerosis function of salvianolate may be associated with decreasing CD36mRNA expression and reducing macrophage foam cell formation，but not with SR-A.

[Key words]Salvianolate；ApoE-knockout mice；Scarvenger receptor；Atherosclerosis

[中圖分類號(hào)]R543.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.05.020

[作者單位]250031山東濟(jì)南，解放軍456醫(yī)院（蔡學(xué)杰）；濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科（高玉琪，李曉燕），實(shí)驗(yàn)診斷科（陳英劍）；200003上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院心內(nèi)科（梁春，吳宗貴）

[通訊作者]高玉琪，Email：why66390@126.com