王　茜，李玉艷，梁志清，包碧慧

(第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院婦產科，重慶 400038)

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小鼠原始生殖細胞分離培養(yǎng)方式和生物特性研究*

王茜，李玉艷，梁志清△，包碧慧

(第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院婦產科，重慶 400038)

[摘要]目的探索一種簡單高效的分離、培養(yǎng)小鼠原始生殖細胞(PGCs)的方法，為小鼠模型提供充足的PGCs來源。方法體外分離小鼠12.5 dpc胚胎生殖嵴，剪碎后用含血清、胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、卵泡刺激素、重組表皮生長因子的α-MEM培養(yǎng)基進行組織塊貼壁培養(yǎng)；于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，采用流式細胞術檢測階段性特異性胚胎抗原，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)、細胞免疫熒光等方法檢測干細胞的多能性基因Oct4及減數(shù)分裂Ⅰ期的幾個特異性基因的表達。結果體外分離培養(yǎng)的小鼠PGCs具有良好的細胞形態(tài)、極強的增殖能力，SSEA-1表達陽性，SSEA-4表達陰性，同時檢測到Oct4、Stra8、Vasa、SCP3、ZP3表達均為陽性。結論利用該實驗方法能培養(yǎng)出高純度、具有良好干性及極強增殖能力的小鼠PGCs，并使該細胞進入減數(shù)分裂。

[關鍵詞]小鼠原始生殖細胞；細胞培養(yǎng)；減數(shù)分裂

目前，已有3種生殖細胞可以演化出多能干細胞，它們分別為：胚胎生殖細胞(embryonic germ cells，EGCs)、胚胎癌細胞(embryonic carcinoma cells，ECCs)及多潛能種系干細胞(multipotentgermline stem cells，MGSC-s)[1-3]。其中，來源于原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)的EGC較ECC和MGSC，具有建系效率高，取材容易等優(yōu)勢，因此在多能干細胞的培養(yǎng)中，利用PGCs進行培養(yǎng)更加便利。雖然國內外多家實驗室對PGCs培養(yǎng)進行了相關研究[4-7]，但均采用培養(yǎng)于STO飼養(yǎng)層上的方法，培養(yǎng)周期長且步驟繁瑣。本研究取12.5 dpc小鼠胚胎生殖嵴行組織塊貼壁培養(yǎng)PGCs并進行鑒定，為建立小鼠EGCs系奠定實驗基礎，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1動物與試劑8～10周齡雌、雄Balb/c小鼠(購自第三軍醫(yī)大學動物中心)。L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素混合溶液(100×雙抗)：Gibco公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶：Hyclone公司；丙酮酸鈉、維甲酸、明膠、牛血清清蛋白：Sigma 公司；胎牛血清：PAN-Biotech GmbH公司；胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑：Atcc公司；卵泡刺激素、重組表皮生長因子：Prospec公司；階段特異性胚胎抗原(stage specific embryonic antigens，SSEA)-1抗體：Biolegend公司；SSEA-4抗體、Vasa抗體、Scp3抗體：Abcam公司；BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒、FITC及Cy3標記的羊抗鼠二抗：碧云天公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒：TaKaRa公司。

1.2小鼠PGCs(mPGCs)體外分離與培養(yǎng)參照Hayashi等[8]報道方法，(1)實驗用12.5 dpc(days posteoltum，發(fā)現(xiàn)陰栓的當天記為0.5 dpc)孕鼠斷頸處死后于75%乙醇中浸泡15 min，無菌條件下取出小鼠子宮，再從中取出胎鼠，置于DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)；(2)解剖顯微鏡下分離出胎鼠生殖腺，去除中腎保留生殖嵴，將收集的生殖嵴組織置于15 mL的離心管后用2～3倍體積的PBS沖洗3次。(3)顯微剪剪碎生殖嵴后，以每孔1～3個生殖嵴的密度接種于0.1%明膠包被2 h的24孔板，培養(yǎng)體系為α-MEM培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清、1%胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、1 ng/mL重組表皮生長因子、0.1 mmol/L卵泡刺激素、 0.23 mmol/L丙酮酸鈉、10 μmol/L維甲酸)，置于5% CO2、95%濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；(4)培養(yǎng)24 h后全量換液，每3天換液1次，待組織塊爬出細胞達到80%融合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代于明膠包被過的新培養(yǎng)皿，隔天換液；倒置相差顯微鏡下持續(xù)觀察并記錄培養(yǎng)細胞的生長情況。

1.3表面標記流式分析用流式細胞儀對第3代細胞的表面特異性抗原進行檢查。0.25%胰蛋白酶消化待檢細胞1～2 min，含血清培養(yǎng)基終止消化后，收集細胞，室溫離心5 min(1 000 r/min)，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗后再次離心，PBS重懸，血細胞計數(shù)儀計數(shù)，調整細胞濃度為(0.5～1.0)×106個/mL，吸取1 mL細胞懸液加入1.5 mL EP管中，室溫下1 000 r/min離心5 min，100 μL PBS重懸沉淀細胞，加入0.5 μL待檢抗體，4 ℃避光孵育30 min，期間混勻2次，1 mL PBS混勻，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清液，1 mL PBS沖洗，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復2次。200 μL PBS重懸后用300目濾網(wǎng)過濾細胞，流式細胞儀分析鑒定。

1.4堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色第3代細胞吸去培養(yǎng)基后用PBS漂洗3次，每次2 min，加入4%多聚甲醛室溫下固定3 min，PBS漂洗3～4次，每次2 min；加入現(xiàn)配染色工作液共3.03 mL[包含：BCIP溶液(300×)10 μL、NBT溶液(150×)20 μL、AP顯色緩沖液3 mL]，室溫避光孵育5～30 min，去除染色工作液后，用蒸餾水洗滌1～2次。

1.5細胞免疫熒光染色細胞經4%多聚甲醛固定10 min。用PBS充分漂洗3次，每次3 min，穿膜處理20 min，PBS充分漂洗2次，每次3 min，加入5%BSA封閉20～30 min。滴加稀釋適度的一抗(VASA抗體1∶400稀釋，SCP3抗體1∶100稀釋)，4 ℃冰箱孵育過夜。PBS充分漂洗3次，滴加熒光標記的二抗37 ℃避光孵育1 h。PBS沖洗3次，每次5 min，滴加DAPI染色3～5 min，PBS漂洗3次后封片，記錄。

1.6實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)采用RT-PCR法檢測第3代細胞特異性基因Oct4、Stra8、Vasa、Scp3、Zp3在mRNA水平的表達，以GAPDH作內參進行PCR。引物序列如下。Oct4 上游：CTG TAA CCG GCG CCA GAA，下游：TGC ATG TGA GAG CCC AGA，其擴增片段長237 bp；Stra8上游：GCC CAG CGT CTG TCT AAC C，下游：CAA CAT CAC GTC GTC ATC C，其擴增片段長171 bp；Vasa上游：ATA ATC ATT TAG CAC AAC CT，下游：GGG AGT AAG AAC AGA AGA AC，其擴增片段長372 bp；SCP3上游：ATG ATG GAA ACT CAG CAG CAA CAG A，下游：TTG ACA CAA TCG TGG AGA GAA CAA C，其擴增片段長301 bp；ZP3上游：CGG CCA GAG ACT CTC CAG TT，下游：ATG TAG AGC GTA TTT CTG GAG CTG TT，其擴增片段長71 bp；GAPDH 上游：GAG AAT GGG AAG CTT GTC ATC AAC GGG AAG，下游：CCC ATC ACC ATC TTC CAG GAG CGA GAC CCC，其擴增片段長181 bp。PCR循環(huán)參數(shù)：(1)預變性:95 ℃ 5 min；(2)95 ℃ 30 s 退火溫度59 ℃，退火時間30 s，72 ℃延伸45 s共35個循環(huán)；(3)72 ℃繼續(xù)延伸 5 min，4 ℃ 10 min。電泳檢測:用0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在多向分析凝膠成像系統(tǒng)中掃描，并進行分析。

2結果

2.1倒置相差顯微鏡下觀察胎鼠生殖腺及PGCs細胞的形態(tài)學特點胎鼠生殖腺呈條索狀，于背側后壁對稱分布，均由生殖嵴及中腎構成。原始睪丸因直細精管呈條紋樣(圖1A)，原始卵巢則較小且有斑點(圖1B)。生殖嵴組織塊3～5 d開始爬出貼壁細胞，5～7 d細胞能生長至70%～80%融合，細胞輪廓清楚，排列緊密，大部分細胞形態(tài)為核質比大的圓形或橢圓形細胞(圖1C)；到80%左右融合狀態(tài)時傳代，傳代接種的細胞密度為(0.5～1.0)×104個/cm2，傳代后細胞增殖迅速，常于傳代后3 d再次接近融合狀態(tài)，能連續(xù)傳代6代以上。

A：12.5 dpc原始睪丸(×200)；B：12.5dpc原始卵巢(×200)；C：培養(yǎng)6 d的原代PGCs(×100)。

圖1顯微鏡下的胎鼠生殖腺及PGCs細胞

A：SSEA-1;B：SSEA-4。

圖2第3代PGCs免疫表型的FCM分析鑒定

2.2流式細胞儀檢測傳至第3代的mPGCs，階段特異性胚胎抗原SSEA-1表達陽性，SSEA-4表達陰性，見圖2。

2.3AP染色細胞持續(xù)AP陽性，表明含有堿性磷酸酶活性陽性的胚胎PGCs,見圖3。

圖3　第3代PGCs的AP染色鑒定圖(×100)

2.4細胞免疫熒光染色Vasa和Scp3的表達是生殖細胞特有的減數(shù)分裂基因。培養(yǎng)至第3代的mPGCs免疫熒光染色顯示，絕大部分細胞均表達Vasa和Scp3，見圖4。

A：Vasa;B：Scp3。

圖4第3代PGCs免疫熒光鑒定圖(×200)

2.5RT-PCR檢測結果第3代mPGCs采用RT-PCR方法檢測其特異性基因的表達。電泳結果如圖5所示，經連續(xù)傳代后mPGCs在mRNA水平上存在基因Oct4、Vasa(DDX4)、Stra8、Scp3、ZP3表達。

1：Marker，2：GAPDH，3：ZP3；4：Stra8；5：Oct4；6：Scp3；7：Vasa。

圖5RT-PCR檢測第3代PGCs減數(shù)分裂特異性基因的表達

3討論

PGCs分化自外胚層細胞，mPGCs最早可在7～7.5 dpc于尿囊基膜附近被發(fā)現(xiàn)，并于12.5 dpc到達生殖腺。12.5 dpc的胎鼠生殖嵴、生殖細胞處于減數(shù)分裂前期，而13.5 dpc生殖嵴的PGCs已開始減數(shù)分裂，提示12.5 dpc的PGCs可能是研究卵子發(fā)生的關鍵時期[5-8]。因此本研究中，首要解決問題即為分離12.5 dpc胎鼠生殖嵴。該時間段胎鼠組織體積小，平均5～8 mm，且脆性極大，生殖嵴更是于顯微鏡下也尋找不易，導致提取時間長，組織易污染，細胞活性減低等情況，均增加了實驗難度。參照Hayashi等[8]的方法將胎鼠從雌鼠子宮取出后，置于DMEM高糖培養(yǎng)液進行生殖腺分離，減少了組織污染，有利于保留組織細胞的活力；分離出胎鼠生殖腺后，采用彎針去除中腎保留生殖嵴，較之使用顯微鑷等工具，更能將中腎剔除干凈，利于后續(xù)培養(yǎng)中細胞的純化。

傳統(tǒng)培養(yǎng)PGCs的方法均是將PGCs細胞接種在成纖維細胞制備的飼養(yǎng)層表面，使其在飼養(yǎng)層表面不斷生長與發(fā)育[4-7,9]。但該方法步驟繁瑣且耗時較長。本實驗采取將12.5 dpc胎鼠生殖嵴剪碎后，直接行組織塊貼壁培養(yǎng)，首先省去了將組織消化為單細胞這一步驟，減少了因消化不足或消化過度對細胞的影響；其次本方法省略了制備飼養(yǎng)層，降低了因飼養(yǎng)層質量不穩(wěn)定，而對PGCs培養(yǎng)的影響。培養(yǎng)3～5 d后在倒置相差顯微鏡下可觀察到從組織塊爬出PGCs細胞，5～7 d細胞即可生長至70%～80%融合進行傳代，又在培養(yǎng)時間上短于傳統(tǒng)飼養(yǎng)層法。本試驗的直接貼壁法，較之傳統(tǒng)的飼養(yǎng)層法，不僅簡化了實驗步驟，又縮短了培養(yǎng)時間。而且通過后續(xù)SSEA-1、SSEA-4檢測、AP染色等初步鑒定是mPGCs。

SSEA是一種糖蛋白，一般表達于胚胎發(fā)育早期，也可表達于未分化的多能性干細胞，故其表達具有種屬特異性[10]。且研究發(fā)現(xiàn)，人類及某些靈長類ECCs中，表達SSEA-3、SSEA-4，不表達SSEA-1，而其EGCs中SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4均為陽性表達，與之不同的是小鼠EGCs和ECCs表達SSEA-1，卻不表達SSEA-3或SSEA-4。在本研究中，分離的mPGCs通過流式細胞儀鑒定表達SSEA-1，不表達SSEA-4，與小鼠EGCs細胞表達相似，表明本研究所培養(yǎng)的細胞屬于小鼠的EGCs。而該細胞AP染色陽性，結合其主要在未分化或低分化狀態(tài)的細胞中呈陽性反應的特點[11]，表明該培養(yǎng)方法可使mPGCs在保持不分化的同時，還能繼續(xù)生長與增殖。

Oct4是POU轉錄因子家族的一員，由Pou5 f1基因編碼產生。Oct4與細胞的亞全能性有關[12]，在未分化的EGCs、ECCs和MGSCs及生殖系細胞中均有表達[13]，其表達與細胞的功能有關，維持一定水平的Oct4表達對干細胞自我更新和多能性的維持起重要作用。有研究表明，Oct4最早在所有卵裂球都有表達，之后表達局限于內細胞團，在滋養(yǎng)外胚層和原始內胚層則表達下調。且一旦PGCs啟動分化，其表達立即下調，不僅如此，Oct4表達的定量分析揭示，Oct4的表達降低，PGCs細胞會朝向滋養(yǎng)外胚層分化[14]。說明Oct4 基因的表達對維持PGCs的未分化狀態(tài)具有十分重要的意義。Stra8是哺乳動物生殖細胞由有絲分裂轉變?yōu)闇p數(shù)分裂前特異表達的基因，即系減速分裂的早期標志[15]。Vasa則為PGC s遷移后期標志基因，位于人類染色體5q且靠近著絲點。Vasa基因在兩性生殖細胞中特異表達，在其遷移后期到減數(shù)分裂后的生殖細胞中均有表達[16]。Scp3即聯(lián)會復合體蛋白3是生殖細胞減數(shù)分裂中聯(lián)會復合體側生元件的核心部分，其表達對于第一次減數(shù)分裂的完成具有重要作用，系減速分裂特異標志基因[17]。而Zp3是組成透明帶最外層的一種硫酸糖蛋白，是卵母細胞向生殖細胞分化發(fā)育形成初級卵母細胞、次級卵母細胞、極體及透明帶的標記物[18]。本研究中，經過細胞免疫熒光染色及RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Oct4、Stra8、Vasa、Scp3、Zp3均為陽性表達，表明本研究培養(yǎng)的PGCs不僅是一種來自小鼠胚胎早期的胚胎生殖細胞，處于未分化狀態(tài)，而且可進入減數(shù)分裂Ⅰ期。

綜上所述，本試驗已成功地進行了mPGCs體外增殖培養(yǎng)研究，所用組織塊直接貼壁法較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法具有簡單、穩(wěn)定，操作便利等優(yōu)勢。且通過上述鑒定，證明該方法培養(yǎng)后，mPGCs均能表達標志多能性的Oct4基因及減數(shù)分裂Ⅰ期的幾個特異標志物Stra8、Vasa、SCP3、ZP3。但目前尚未能進一步證實，在體外培養(yǎng)下能否最終完成減數(shù)分裂。因此還需要進一步探索適合PGCs生長的培養(yǎng)體系，期望能進一步研究體外培養(yǎng)PGCs完成減數(shù)分裂的可能性機制，同時也為建立小鼠EGCs系奠定實驗基礎。

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Study on isolation and culture modes of mouse primordial germ cell and its biological characteristics*

Wang Xi,Li Yuyan,Liang Zhiqing△,Bao Bihui

(Department of Obstetrics and Gynecology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore a simple and efficient method for isolating and culturing mouse primordial germ cells(mPGCs) in vitro in order to provide the sufficient mPGCs sources of mouse model.MethodsThe 12.5 dpc mouse embryonic genital ridge were isolated in vitro and cut into pieces,then the organization to adherent culture was performed in a-MEM medium containing fetal calf serum and insulin-transferrin-selenium (ITS) and follicle stimulating hormone(FSH) and recombinant endothelial growth factor(rEGF).The inverted microscope was used to observe the cellular morphology.Flow cytometry was used to identify the stage specific embryonic antigens of cultured cells.Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and immunofluorescence were used to identify the pluripotency gene Oct4 expressions of stem cells and specific genes in the meiosis phaseⅠ.ResultsThe in vitro isolated and cultured mPGCs showed good cell morphology,extremely strong proliferation capacity and the positive expression of SSEA-1 and negative expression of SSEA-4,Oct4,meanwhile the expressions of Stra8,Vasa,Scp3,Zp3 were detected to be positive.ConclusionUsing this culture method can culture the high purity of mPGCs with the excellent stem cell properties and extremely strong proliferative ability,moreover which makes the cells entering the meiosis stage.

[Key words]mouse primordial germ cells;cell culture;meiosis

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.003

* 基金項目：國家自然科學基金項目資助(31101058)；重慶市自然科學基金資助項目(CSTC2011jjA10075)。

作者簡介：王茜(1990-)，碩士在讀，主要從事生殖醫(yī)學研究工作?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：zhi.lzliang@gmail.com。

[中圖分類號]Q813.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1159-04

(收稿日期：2015-10-22修回日期：2015-12-26)