韓貴賓，張 壽，孫薇薇，鐘海波，陳建強(qiáng)，范忠誠（?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心，?？?570208）

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尼古丁抑制MIA誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡

韓貴賓，張 壽，孫薇薇，鐘海波，陳建強(qiáng)，范忠誠
（?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心，?？?570208）

【摘要】目的 探討尼古丁抑制碘乙酸鈉（MIA）誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡。方法 酶消化法分離大鼠原代軟骨細(xì)胞，并用10－8，10－7，10－6，10－5mol/ L尼古丁處理細(xì)胞48 h，隨后實(shí)驗(yàn)分為5組，除正常組外，其余4組皆用4 μM MIA處理24 h，并給予尼古丁。MTT法檢測各組軟骨細(xì)胞活力；Annexin V-FITC/ PI流式雙染細(xì)胞術(shù)檢測各組軟骨細(xì)胞凋亡；分光光度法檢測各組軟骨細(xì)胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase 3）活性；Western blot分析磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）激活狀況及下游靶分子Bax，Bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果10－7，10－6mol/ L尼古丁顯著促進(jìn)大鼠軟骨細(xì)胞活力（P＜0. 05），10－5mol/ L尼古丁顯著降低大鼠軟骨細(xì)胞活力（P＜0. 05），10－8mol/ L尼古丁對大鼠軟骨細(xì)胞活力無影響（P＞0. 05）。10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能劑量依賴性的提高M(jìn)IA誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞活力，并抑制MIA誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡及Caspase 3活性（P＜0. 05）；10－7，10－6mol/ L尼古丁能提高PI3K表達(dá)及AKT磷酸化水平，并下調(diào)促Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)（P＜0. 05）。結(jié)論 一定劑量尼古丁能顯著的抑制MIA誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡，可能與PI3K/ AKT信號通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】關(guān)鍵詞尼古??；骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；凋亡

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，其中軟骨病變是骨關(guān)節(jié)炎的中心環(huán)節(jié)［1］。軟骨細(xì)胞是軟骨中唯一細(xì)胞結(jié)構(gòu)，一旦軟骨細(xì)胞死亡，只能緩慢再生甚至無法再生，而軟骨細(xì)胞的死亡又破壞了胞外基質(zhì)合成及降解的平衡，從而進(jìn)一步加劇OA［2］。軟骨細(xì)胞的凋亡受多種信號通路調(diào)節(jié)，其中包括PI3K/ AKT，此通路的持續(xù)激活，能使軟骨細(xì)胞維持增殖活力，并調(diào)節(jié)下游靶基因Bax，Bcl-2及Caspase 3的表達(dá)［3］。

一定劑量尼古丁能顯著促進(jìn)包括軟骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖活力。如Liu等［4］報(bào)道在碘乙酸鈉（MIA）誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠中，尼古丁通過與乙酰膽堿受體α7結(jié)合，從而改善大鼠大體及病理形態(tài)，并抑制大鼠軟骨細(xì)胞凋亡。Zheng等［5］通過MTT及DAPI實(shí)驗(yàn)證實(shí)10－7M尼古丁能顯著抑制白介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞凋亡。但尼古丁對于軟骨細(xì)胞凋亡的抑制作用機(jī)制尚未見報(bào)道，因此本文旨在考察尼古丁是否能過通過PI3K/ AKT信號通路從而阻斷MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

1　材料和方法

1.1藥品和試劑

尼古丁購自美國sigma公司，批號：4408；兔抗Bax，Bcl-2，PI3K，AKT，p-AKT，GDAPH抗體購自Epitmics公司；Annexin V-FITC/ PI流式雙染細(xì)胞，Caspase 3檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，DMEM/ F-12培養(yǎng)基，二型膠原酶，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自Gibco公司。

1.2大鼠軟骨細(xì)胞的制備［6］

無菌環(huán)境下，刮取100 g左右SD大鼠（購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司【SCXK（滬2012－ 0002】）雙側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨坪、髕骨內(nèi)側(cè)透明軟骨，剪碎至1 mm3大小。依次用0. 25%的胰蛋白酶及0. 2%的膠原酶消化。得到單細(xì)胞懸液，用DMEM/ F-12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞（含20%胎牛血清，100 U/ mL青霉素，100 U/ mL鏈霉素），在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約5～6 d細(xì)胞開始融合，實(shí)驗(yàn)使用第2～3代細(xì)胞。

1.3軟骨細(xì)胞活力檢測（MTT法）

將第2～3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行消化，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個細(xì)胞/ mL，接種，于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5%胎牛血清的DMEM/ F-12（含4 μmol/ L MIA及10－8，10－7，10－6，10－5mol/ L尼古?。┡囵B(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加MTT（5 mg/ mL）20 μL，4 h后，棄上清，并每孔加入DMSO 150 μL，10 min后，酶標(biāo)儀570 nm處測定OD值，以O(shè)D值代表細(xì)胞活力。

1.4Annexin V-FITC流式細(xì)胞法檢測軟骨細(xì)胞凋亡

將第2～3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個細(xì)胞/ mL，接種，于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5%胎牛血清的DMEM/ F-12培養(yǎng)基、尼古丁（終濃度為10－8，10－7，10－6mol/ L）和MIA（終濃度為4 μmol/ L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按照Annexin V-FITC/ PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，用0. 25%的胰蛋白酶（不含EDTA）消化，PBS洗滌，2000 r/ min離心5 min，收集細(xì)胞；加入Binding Buffer 500 μL懸浮細(xì)胞，隨后加入Annexin V-FITC 5 μL混勻后，加入PI 5 μL，混勻，于室溫避光反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5Caspase 3活性檢測

將第2～3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個細(xì)胞/ mL，接種，于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入含5%小牛血清的DMEM/ F-12培養(yǎng)基、尼古?。ńK濃度為10－8，10－7，10－6mol/ L）和MIA（終濃度為4 μmol/ L），繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按Caspase 3分光光度法檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

1.6Western blotting

收集處理過的樣本，加入裂解液裂解，離心，獲得蛋白樣品。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗4℃孵育過夜。次日加二抗孵育后曝光。用“Quantity One”軟件對各蛋白條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1尼古丁對大鼠軟骨細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著提高軟骨細(xì)胞活力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）；而10－5mol/ L尼古丁對軟骨細(xì)胞活力具有顯著抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）；10－8mol/ L尼古丁對軟骨細(xì)胞活力影響不大（P＞0. 05）。

圖1　尼古丁對大鼠軟骨細(xì)胞活力的影響Note：Compared with normal control group，aaP＜0. 01.Fig. 1 Effect of nicotine on rat chondrocytes viability

2.2尼古丁對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，4 μmol/ L MIA顯著抑制軟骨細(xì)胞活力，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著提高M(jìn)IA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）。

2.3尼古丁對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示，4 μmol/ L MIA顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著抑制MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

2.4尼古丁對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞PI3K/ AKT信號通路的影響

如圖4所示，4 μmol/ L MIA顯著抑制PI3K表達(dá)和AKT的磷酸化程度，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能提高PI3K表達(dá)，10－7，10－6mol/ L尼古丁能提高AKT磷酸化水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）。

2.5尼古丁對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Bax及Bcl-2表達(dá)的影響

如圖5所示，4 μmol/ L MIA顯著提高Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，而10－7，10－6mol/ L尼古丁能下調(diào)Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）。

圖2　尼古丁對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活力的影響Note：Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01.Fig. 2 Effect of nicotine on viability of ratchondrocytes induced by MIA

2.6尼古丁對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Caspase 3活性的影響

如圖6所示，4 μmol/ L MIA顯著提高軟骨細(xì)胞Caspase 3活性，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著抑制MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Caspase 3活性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 01）。

3　結(jié)論

Ying等［7］研究結(jié)果表明10－7，10－6mol/ L尼古丁能促進(jìn)骨髓干細(xì)胞增殖并向軟骨細(xì)胞分化，并隨著時(shí)間延長能逐漸誘導(dǎo)二型膠原蛋白的表達(dá)，而10－5mol/ L尼古丁可顯著的抑制骨髓干細(xì)胞增殖。Schraufstatter等［8］報(bào)道10－5mol/ L尼古丁會導(dǎo)致人間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡。說明不同劑量尼古丁對細(xì)胞增殖活力影響具有顯著差異，本實(shí)驗(yàn)研究表明10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著提高軟骨細(xì)胞活力，而10－5mol/ L尼古丁對軟骨細(xì)胞活力具有顯著抑制作用，與上述報(bào)道一致，說明在一定濃度范圍內(nèi)尼古丁對大鼠軟骨細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用。而多種因素可引起軟骨細(xì)胞損傷乃至死亡，如軟骨表面應(yīng)力異常，細(xì)胞因子（如IL-1β、TNF-α等）的作用，NO、能量代謝抑制劑（如MIA）等。其中MIA為糖酵解途徑中3-磷酸甘油醛脫氫酶抑制劑，通過抑制細(xì)胞能量代謝而導(dǎo)致細(xì)胞因供養(yǎng)不足而死亡［9］。MIA體外刺激24 h，亦能造成大鼠軟骨細(xì)胞的死亡［10－11］。本實(shí)驗(yàn)亦表明MIA誘導(dǎo)24 h會降低軟骨細(xì)胞活力，并使細(xì)胞凋亡顯著。且10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著抑制MIA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，與Zheng等［5］觀點(diǎn)一致。

圖3　尼古丁對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響Note：Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01. A：normal control group；B：model group；C：10－8mol/ L nicotine +4 μmol/ L MIA；D：10－7mol/ L nicotine +4 μmol/ L MIA；E：10－6mol/ L nicotine +4 μmol/ L MIA.Fig. 3 Effect of nicotine on apoptosis of rat chondrocytes induced by MIA

正常生理狀態(tài)下，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡與增殖處于動態(tài)平衡，而在OA等病理狀態(tài)下，軟骨細(xì)胞凋亡占主要方面，且關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的異常會引起OA。PI3K/ AKT信號通路在OA軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用［3］。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性，其代謝產(chǎn)物4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）和1，4，5-三磷酸肌醇（PIP3）可以激活A(yù)KT蛋白上的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。PI3K/ AKT信號通路調(diào)節(jié)眾多靶分子表達(dá)，如Bax，Bcl-2，Caspase 3等，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡活動［3］。PI3K抑制劑LY294002加入到大鼠脛骨軟骨細(xì)胞中，使軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)目增多，且軟骨細(xì)胞生長緩慢［12］。胰島素生長因子-1通過激活兔軟骨細(xì)胞PI3K/ AKT信號通路拮抗軟骨細(xì)胞凋亡，而PI3K抑制劑LY294002加入使軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)目增加［13］。這些提示PI3K/ AKT途徑是抗軟骨細(xì)胞凋亡作用的重要途徑。并且李舒潔等［14］研究表明，MIA促使大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的同時(shí)，伴隨著AKT磷酸化水平的降低，Bax表達(dá)量的提高及Bcl-2表達(dá)量的降低。本研究也發(fā)現(xiàn)，在MIA誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞中，PI3K表達(dá)及AKT磷酸化程度下降，而10－7，10－6mol/ L尼古丁顯著促進(jìn)PI3K表達(dá)及AKT磷酸化。Nishioka等［15］研究結(jié)果也表明尼古丁可通過激活PI3K/ Akt信號通路來抵抗肺癌細(xì)胞凋亡。說明尼古丁可通過PI3K/ AKT信號通路來抵抗MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

軟骨細(xì)胞的凋亡受凋亡基因的嚴(yán)格控制，如Bcl-2家族，能與Bax亞家族成員，相互作用，啟動軟骨細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在關(guān)節(jié)炎患者血清中，Bax含量顯著上升，Bcl-2含量下降［16］，通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，能顯著抑制軟骨細(xì)胞凋亡［17］，本研究結(jié)果也顯示MIA能上調(diào)軟骨細(xì)胞的Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，而10－7，10－6mol/ L尼古丁減弱MIA誘導(dǎo)的這種變化。Caspase是一類進(jìn)化上保守的天冬氨酸蛋白酶家族，依賴Caspase的信號途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑。Caspase 3抑制劑Z-DEVD-FMK或Ac-DMQD-CHO在體外證實(shí)能抑制由膠原酶引起的軟骨細(xì)胞凋亡［18］。碘乙酸鈉能誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞凋亡，與促進(jìn)Caspase 3的活化有關(guān)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中Caspase 3活性顯著提高，10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁可顯著降低Caspase 3活性。

圖4　尼古丁對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞PI3K/ AKT信號通路的影響與正常組比較，aaP＜0. 05；與模型組比較，bbP＜0. 01Fig. 4 Effect of nicotine on PI3K/ AKT signal pathway in rat chondrocytes induced by MIA Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01

圖5　尼古丁對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Bax及Bcl-2表達(dá)的影響與正常組比較，aaP＜0. 05；與模型組比較，bbP＜0. 01Fig. 5 Effect of nicotine on the expression of Bax and Bcl-2 in rat chondrocytes induced by MIA Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bP＜0. 05，bbP＜0. 01

綜上所述，10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁具有保護(hù)軟骨細(xì)胞作用，可抑制MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡并抑制Caspase 3活性，10－7，10－6mol/ L尼古丁可下調(diào)Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，并抑制PI3K表達(dá)及AKT磷酸化水平。

圖6　尼古丁對MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Caspase 3活性的影響與正常組比較，aaP＜0. 05；與模型組比較，bP＜0. 05，bbP＜0. 01Fig. 6 Effect of nicotine on the activity of Caspase 3 in rat chondrocytes induced by MIA Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bP＜0. 05，bbP＜0. 01

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〔修回日期〕2015－11－13

Inhibition of nicotine on apoptosis of chondrocytes induced by monosodium iodoacetate

HAN Gui-bin，ZHANG Shou，SUN Wei-wei，ZHONG Hai-tao，CHEN Jian-qiang，F(xiàn)AN Zhong-cheng

【Abstract】Objective To explore inhibition of nicotine on apoptosis of chondrocytes induced by monosodium iodoacetate（MIA）. Methods Rat primary chondrocytes were isolated by enzyme digestion，and the cells were treated with 10－8，10－7，10－6，10－5mol/ L nicotine for 48 h. The cases were randomly divided into five groups，except for normal group，the other four groups were treated with 4 μmol/ L MIA 24 h，and three groups were treated 10－8，10－7，10－6mol/ L nicotine. The viability of chondrocytes was detected by MTT assay. The apoptosis of chondrocytes was examed by Annexin V-FITC/ PI flow dual-staining method. The activity of cysteinyl aspartate specific proteinase 3（Caspase 3）was measured by spectrophotography method. The activation of phosphatidylinositol 3 kinase（PI3K）/ protein kinase B（AKT）and the expression of down-stream molecule Bax，Bcl-2 was assayed by western blot. Results 10－7，10－6mol/ L nicotine increased chondrocytes’viability（P＜0. 05），10－5mol/ L nicotine reduced chondrocytes’viability（P＜0. 05），and 10－8mol/ L nicotine didn‘t effect on chondrocytes’viability（P＞0. 05）. 10－8，10－7，10－6mol/ L nicotine could increaseMIA-induced chondrocytes’viability（P＜0. 05），suppress MIA-induced chondrocytes’apoptosis and the activity of MIA-induced Caspase 3（P＜0. 05）. Moreover，10－7，10－6mol/ L nicotine could increase the expression of PI3K and phosphorylation of AKT（P＜0. 05），down-regulate the expression of Bax and up-regulate the expression of Bcl-2 in MIA-induced rat chondrocytes（P＜0. 05）. Conclusion These results suggested nicotine could exert anti-apoptosis in MIA-induced rat chondrocytes，which might be related to PI3K/ AKT signal pathway.

【Key words】Nicotine；Ostearthritis；Chondrocytes；Apoptosis

【中圖分類號】R-332

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0040-00

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 009

［基金項(xiàng)目］海南省衛(wèi)生廳基金資助項(xiàng)目（瓊衛(wèi)－2013資助－036號）。

［作者簡介］韓貴賓（1974－），男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：關(guān)節(jié)外科。E-mail：hanguibin456@163. com。

［通訊作者］張壽，Email：shouzhang456@163. com。