范　超,張　燕,何建維,陳　鳴,鄧少麗

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗科,重慶 400042)

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重慶地區(qū)冠心病介入治療患者CYP2C19基因多態(tài)性分布*

范超,張燕,何建維,陳鳴,鄧少麗△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗科,重慶 400042)

[摘要]目的研究重慶地區(qū)冠心病介入治療患者CYP2C19 基因多態(tài)性的分布。方法選取該院2015年第1季度心血管內(nèi)科住院，明確診斷為冠心病，同意行冠狀動脈支架術(shù)(PCI)并使用氯吡格雷進行抗血小板治療的患者共152例。抽取其外周血并通過提取基因組DNA，檢測CYP2C19的基因型，了解其代謝型的分布。結(jié)果在152例檢測標本中，檢測出CYP2C19的6種基因型，*1/*1型(636GG，681GG)57例(37.5%)，*1/*2型(636GG，681GA)60例(39.5%)，*1/*3型(636GA，681GG)11例(7.2%)，*2/*2型(636GG，681AA)17例(11.2%)，*3/*3型(636AA，681GG)2例(1.3%)，*2/*3型(636GA，681GA)5例(3.3%)。檢測出CYP2C19的3種代謝型，所占比例分別為：快代謝型57例(37．5%)，中間代謝型71例(46.7%)，慢代謝型24例(15.8%)。重慶地區(qū)冠心病介入治療患者CYP2C19位點存在基因多態(tài)性，弱代謝型的發(fā)生率與我國漢族人群幾乎一致，高于重慶地區(qū)健康漢族人群。結(jié)論該地區(qū)進行治療時要重視該酶的基因分型，在條件允許的情況下進行CYP2C19基因分型的檢測，以降低術(shù)后心血管不良事件的發(fā)生概率。

[關(guān)鍵詞]冠心?。唤槿胫委?CYP2C19；基因型;代謝型；氯吡格雷

細胞色素P450(CYP450)是人體內(nèi)主要的藥物代謝酶系，主要存在于肝臟微粒體中,其中CYP2C19酶是CYP450超家族中非常重要的代謝酶。通過CYP2C19代謝的藥物主要有：質(zhì)子泵抑制劑、氯吡咯雷、伏立康唑、抗抑郁藥及抗癲癇藥等。相關(guān)研究證明，藥物洗脫支架內(nèi)血栓[1]是冠狀動脈支架術(shù)(PCI)后患者嚴重的并發(fā)癥之一，為了降低冠心病患者該并發(fā)癥的發(fā)生率，目前臨床使用最廣泛的藥物是氯吡咯雷[2]，它是一種前體型藥物，需要經(jīng)過CYP2C19酶的代謝才會發(fā)揮其活性。但近年來研究結(jié)果表明，應(yīng)用氯吡格雷治療的部分患者存在氯吡格雷抵抗現(xiàn)象[3]。有研究認為氯吡格雷抵抗主要與CYP2C19基因突變有關(guān)[4-5]，CYP2C19基因存在多態(tài)性，在我國漢族人群中，主要的突變位點為CYP2C19*2(681G-A)和CYP2C19*3(636G-A)，而攜帶CYP2C19*2/CYP2C19*3基因的患者與氯吡格雷抵抗的發(fā)生呈正相關(guān)[6]。根據(jù)個體對藥物代謝速率的不同，又可將個體分為快代謝(EM)型、中間代謝(IM)型及慢代謝(PM)型，因為不同代謝表型的個體間存在代謝速度上的差異，從而導(dǎo)致了血藥濃度的個體化差異。本研究采用基因芯片方法對重慶地區(qū)152例氯吡格雷治療的冠心病支架術(shù)患者進行CYP2C19基因位點分型，旨在了解重慶地區(qū)冠心病患者的CYP2C19基因多態(tài)性的分布情況，進而了解代謝表型的分布情況，并與重慶地區(qū)漢族健康人群的3種代謝表型的發(fā)生率進行比較，為重慶地區(qū)氯吡格雷治療患者的臨床個體化用藥方案提供資料，減少不良心血管事件的發(fā)生。

1資料與方法

1.1一般資料選取2015年第1季度在本院心內(nèi)科住院，并確診為冠心病，已行PCI，并且使用氯吡格雷進行抗血小板治療的患者152例，其中男99例，女53例。所有患者為無血緣關(guān)系的重慶漢族人。

1.2儀器與試劑全血基因組DNA提取試劑盒(上海百傲科技有限公司)，含蛋白酶K，緩沖液BL、BW1、BW2、BH1、BH2、BE。CYP2C19基因檢測試劑盒(上海百傲科技有限公司)，含CYP2C19擴增液1、2，反應(yīng)液A、B，基因芯片、陽性對照、陰性對照及雜交顯色試劑盒，顯色試劑盒含預(yù)雜交液，雜交緩沖液，洗液1、2、3，抗體及抗體稀釋液，顯色液。e-Hyb全自動雜交儀(上海百傲科技有限公司)，BE-2．0生物芯片識讀儀(上海百傲科技有限公司)，PCR儀，干式恒溫器，離心機，渦旋振蕩器。

1.3方法

1.3.1DNA提取所有患者在首次服用氯吡格雷前用紫頭管靜脈采血2 mL，按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA。DNA樣本-20 ℃保存，凍融不超過3次。

1.3.2PCR擴增將CYP2C19擴增液1和擴增液2分裝到0.2 mL PCR反應(yīng)管中，擴增反應(yīng)體系為25 μL，包括：CYP2C19擴增液19 μL、反應(yīng)液A 1 μL、DNA模板5 μL。擴增條件為：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min終止反應(yīng)。將擴增產(chǎn)物1和擴增產(chǎn)物2置于2～8 ℃保存。

1.3.3雜交顯色取出雜交顯色試劑盒，將反應(yīng)液B低速離心，吸取10 μL加入雜交緩沖液瓶中混勻。臨用前，取出1支抗體，低速離心，加入1 mL抗體稀釋液，振蕩混勻，制成抗體使用液。取出基因芯片，做好標記，將CYP2C19基因芯片放入雜交儀片架中，旋緊雜交艙蓋。將各試劑按要求分裝到2 mL離心管中，插入試管架中。取180 μL雜交緩沖液于離心管中，再分別加入10 μL擴增產(chǎn)物1和擴增產(chǎn)物2，混勻，放入試管架中。將試管架放入雜交儀中，運行雜交程序。取出芯片，放入生物芯片識讀儀中，用百傲基因芯片圖像分析軟件進行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析，輸出檢測結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行。用頻數(shù)計數(shù)法計算各基因型及等位基因頻率。用χ2檢驗比較各基因型頻率在性別間的差異及與健康人群代謝型頻率之間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1CYP2C19基因多態(tài)性檢測結(jié)果CYP2C19擴增產(chǎn)物經(jīng)基因芯片分析后各種基因型生物芯片識別圖，見圖1。各基因型所占比例分別為:*1/*1型(636GG，681GG)57例(37.5%)，*1/*2型(636GG，681GA)60例(39.5%)，*1/*3型(636GA，681GG)11例(7.2%)，*2/*2型(636GG，681AA)17例(11.2%)，*3/*3型(636AA，681GG)2例(1.3%)，*2/*3型(636GA，681GA)5例(3.3%)。EM型57例(37.5%)，IM型71例(46.7%)，PM型24例(15.8%)。男性和女性的CYP2C19基因型及代謝型在CYP2C19的分布上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1　基因型生物芯片圖

表1　重慶地區(qū)男、女冠心病患者CYP2C19基因多態(tài)性的分布[n(%)]

2.2CYP2C19基因多態(tài)性(代謝型)的比較CYP2C19基因PM型的發(fā)生率與我國漢族人群基本一致。略高于重慶地區(qū)健康漢族人群，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　CYP2C19代謝型比較結(jié)果[n(%)]

3討論

據(jù)目前的研究現(xiàn)狀而言，個體化治療及用藥越來越受到各界的關(guān)注。而這種個體化差異主要源自于人類基因的變異，單核苷酸多態(tài)性(SNP)是人類基因中最常見的變異形式，也是體現(xiàn)人群個體差異的最基本的基因變異。CYP450是人體內(nèi)主要的藥物代謝酶系，主要存在于肝臟微粒體中,其中CYP2C19酶是CYP450超家族中非常重要的代謝酶。通過CYP2C19代謝的藥物很多，主要有質(zhì)子泵抑制劑、氯吡咯雷、伏立康唑、抗抑郁藥及抗癲癇藥等，其中有些藥物如伏立康唑可以直接經(jīng)過CYP2C19酶進行代謝，如果此酶對該類藥物代謝速度過快，易造成患者體內(nèi)血藥濃度過低，從而導(dǎo)致療效不佳；反之，如果該酶代謝藥物速度過慢，易造成患者體內(nèi)血藥濃度過高，從而增加藥物的毒副作用。然而，另一類常用藥物氯吡咯雷，它是一種前體型藥物，需要經(jīng)過CYP2C19酶的代謝才會發(fā)揮其活性，如果此酶對該類藥物代謝速度過快，易造成患者體內(nèi)血藥濃度過高，從而增加藥物毒副作用，如果該酶代謝藥物速度過慢，則易造成患者體內(nèi)血藥濃度過低，直接影響療效。所以為了避免藥物的毒副作用，同時提高藥物的治療效果，臨床應(yīng)該根據(jù)不同患者基因型及代謝型的差異，酌情調(diào)整用藥的劑量，以提高效率[7-8]。

目前已有很多文獻報道不同地區(qū)、種族CYP2C19基因型的多態(tài)性分布情況，但重慶地區(qū)針對疾病人群的研究還不多，故本研究主要研究重慶地區(qū)冠心病支架介入治療患者CYP2C19基因型的多態(tài)性分布。研究結(jié)果顯示，重慶地區(qū)冠心病支架介入治療患者CYP2C19基因型所占比例分別為:*1/*1型37.5%、*1/*2型39.5%、*1/*3型7.2%、*2/*2型11.2%、*3/*3型1.3%、*2/*3型3.3%，并且各個基因型在不同性別間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這與文獻[1,6,9]報道的其他地區(qū)該基因多態(tài)性的分布幾乎一致。EM型占37.5%，IM型46.7%，PM型15.8%,這說明約62.5%的患者對氯吡格雷會出現(xiàn)或重或輕的藥物抵抗作用，這與文獻[1]報道的60%基本一致，PM型15.8%與我國漢族人總體發(fā)生率14.1%幾乎一致，但高于文獻[1，9]報道的9.3%和10%。所以建議重慶地區(qū)的醫(yī)生和冠心病患者在進行治療時要重視該酶的基因分型，在條件允許的情況下進行CYP2C19基因分型的檢測，參考檢測結(jié)果進行治療用藥的選擇和劑量的增減，從而達到個體化用藥的目的，以降低術(shù)后心血管不良事件的發(fā)生概率。

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doi:·經(jīng)驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.032

* 基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81101199)；國家傳染病重大專項資助項目(2013ZX10003006-003-002)。

作者簡介：范超(1989-)，初級技師，本科，主要從事分子生物研究。△通訊作者，E-mail:dengshaoli@tmmu.edu。

[中圖分類號]R34

[文獻標識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)11-1549-03

(收稿日期：2015-10-15修回日期：2015-12-20)