高　月　鄧小芳　雷繼魁

(重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶400700)

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ALEX1基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定①

高月鄧小芳雷繼魁

(重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶400700)

[摘要]目的：探討構(gòu)建Arm重復(fù)蛋白1(ALEX1)基因過表達(dá)慢病毒表達(dá)載體，感染乳腺癌細(xì)胞系SK-BR3后觀察ALEX1的表達(dá)，為研究ALEX1在乳腺癌中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法：利用DNA重組技術(shù)將ALEX1基因插入到慢病毒穿梭質(zhì)粒LV5中，獲得重組慢病毒質(zhì)粒V-ALEX1，經(jīng)酶切鑒定及DNA測序鑒定后，用 Lipofectamine 2000將重組質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞中包裝成重組慢病毒顆粒，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測定重組慢病毒滴度。將成功包裝的ALEX1過表達(dá)慢病毒載體(LV5-ALEX1)和陰性對(duì)照載體(LV5-NC)，感染SK-BR3細(xì)胞(MOI為10)48～72 h，Real-time PCR和Western blot法分析ALEX1表達(dá)情況。結(jié)果：酶切鑒定結(jié)果顯示：產(chǎn)生約1 500 bp的片段，片段大小與ALEX1基因cDNA大小一致。DNA測序比對(duì)說明測序結(jié)果與預(yù)期ALEX1基因序列完全一致，證實(shí)ALEX1基因正確插入載體中，成功構(gòu)建ALEX1基因過表達(dá)載體。經(jīng)293T細(xì)胞包裝后，成功獲得病毒滴度為4.25×108 TU/ml的重組慢病毒LV5-ALEX1。Real-time PCR和western blot結(jié)果顯示：與感染LV5-NC的SK-BR3細(xì)胞相比，LV5-ALEX1感染可明顯增加ALEX1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論：成功構(gòu)建ALEX1基因過表達(dá)慢病毒載體，ALEX1基因過表達(dá)慢病毒能夠感染乳腺癌SK-BR3細(xì)胞，可使外源基因獲得穩(wěn)定過表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]ALEX1；慢病毒；構(gòu)建；鑒定

Arm家族蛋白是指含有Armadillo repeat結(jié)構(gòu)的一類蛋白。Armadillo repeat結(jié)構(gòu)是首次在果蠅的極性基因中發(fā)現(xiàn)，該基因在果蠅的早期細(xì)胞極性形成、維持上皮組織的完整性和早期胚胎形成過程中具有重要作用[1]。ALEX1 (Arm proteins lost in epithelial cancers on chromosome X1)蛋白是Arm重復(fù)蛋白家族成員之一，被認(rèn)為是一種抑癌基因[2]。其在人類多種腫瘤中如肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌中表達(dá)降低或缺失[3-5]。為進(jìn)一步研究ALEX1的功能，本研究成功構(gòu)建人ALEX1基因的慢病毒表達(dá)載體并感染人乳腺癌細(xì)胞系SK-BR3細(xì)胞，為后期進(jìn)行ALEX1基因的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑SK-BR3和293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；RPMI1640 培養(yǎng)基(Hyclone 美國)；dsDNA oligo由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；慢病毒穿梭質(zhì)粒LV5和包裝質(zhì)粒 pGag/Pol、pRev、pVSV-G 購于上海吉瑪公司；E.Z.N.A.?膠回收試劑盒(Omega，美國)；E.Z.N.A.TM質(zhì)粒提取試劑盒(Omega 美國)；限制性內(nèi)切酶NotI和NsiI(TaKaRa，日本)；T4DNA連接酶(NEB 美國)；DNA marker(TaKaRa日本)；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(Invi-trogen美國)；Western blot 檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人ALEX1多克隆抗體購自(Abcam 美國)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體IgG(北京中杉生物有限公司)。RT-PCR試劑盒和熒光定量PCR試劑盒SYBRGreen，ExTaqTM聚合酶Ⅱ(TaKaRa日本)；ALEX1、GAPDH引物由TaKaRa公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ALEX1基因獲取參考GenBank的ALEX1基因序列( NM_016608)設(shè)計(jì)出一對(duì)ALEX1基因引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成引物序列：ALEX1-NotI-F： 5′-GATTGGCGGCCGCGCCACCATGGGCCGCACTCGGGAAGC-3′(NotⅠ酶切位點(diǎn)標(biāo)記為下劃線)。ALEX1-NsiI-R： 5′-GTATAATGCATTTAGAGTTTGGTTAATACTTTCAGGACT-3′；(Ns-iI酶切位點(diǎn)標(biāo)記為下劃線)；按照試劑盒操作說明提取ALEX1 cDNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃30 s，60℃15 s，72℃15 s，30個(gè)循環(huán)回收并純化ALEX1編碼區(qū)片段。

1.2.2V-ALEX1重組質(zhì)粒構(gòu)建擴(kuò)增和鑒定使用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和NsiⅠ線性化LV5載體，利用T4 DNA連接酶將線性化的LV5載體和目的基因ALEX1在連接緩沖液中16℃過夜連接。連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基篩選后，挑取單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)以進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定，DNA測序鑒定獲取重組質(zhì)粒V-ALEX1。

1.2.3重組慢病毒及陰性對(duì)照慢病毒的包裝和濃縮轉(zhuǎn)染前24 h，將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞胰酶消化重懸接種于15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中；待細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)，將重組慢病毒質(zhì)粒V-ALEX1 和pGag/Pol、pRev、pVSV-G經(jīng)Lipofecta mine2000共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，換成含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。72 h后收集病毒上清液，4℃ 4 000 r/min，離心4 min；低速離心后用0.45 μm濾器過濾，4℃ 20 000 r/min超速離心2 h，收集濃縮液-80℃凍存。重組慢病毒命名為LV5-ALEX1，用上述相同方法將LV5與 pGag/Pol、pRev、pVSV-G 經(jīng)Lipofecta mine2000共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，并包裝成能表達(dá)GFP的慢病毒顆粒，命名為：LV5-NC作為陰性對(duì)照。

1.2.4病毒滴度測定293T細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合，胰酶消化重懸細(xì)胞，于96 孔板加入293T細(xì)胞1×104/孔，體積100 μl；取慢病毒原液10 μl，用10% FBS 的DMEM培養(yǎng)液10倍3～5個(gè)梯度，吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μl稀釋的病毒液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，于 37℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h；吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加入100 μl 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃ 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h。通過流式細(xì)胞儀檢測熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。

1.2.5LV5-ALEX1載體及對(duì)照載體感染SK-BR3細(xì)胞將成功包裝的ALEX1過表達(dá)慢病毒載體(LV5-ALEX1)和陰性對(duì)照載體(LV5-NC)，感染SK-BR3細(xì)胞(MOI為10)72 h后，熒光顯微鏡下觀察感染效率。

1.2.6Real-time PCR檢測ALEX1 mRNA表達(dá)篩選后的細(xì)胞加入1 ml TRIzol，按照操作說明提取細(xì)胞總RNA并測定RNA濃度。以1 μg RNA為模板，按照RT-PCR逆轉(zhuǎn)試劑盒操作說明合成cDNA，以1 μl cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。 反應(yīng)條件：95℃10 s預(yù)變性，95℃5 s變性，60℃15 s退火，72℃15 s延伸，40個(gè)循環(huán)。引物序列：ALEX1：5′-TGATATTCTGAGTGCTCCCGACC-3′(上游)，5′-TGTTACCC-AGAGTGACCAAGGCT-3′ (下游)；GAPDH：5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′ (上游)，5′- GTAGAGGCAGGGATGAGTTCT-3′ (下游)。

1.2.5Western blot 檢測ALEX1蛋白表達(dá)以細(xì)胞裂解液裂解篩選后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量，取40 μg蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；加入兔抗人ALEX1(1∶500 稀釋) 抗體，兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜，次日TBST洗膜10 min×5次，再分別與HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗( 1∶3 000)室溫孵育2 h，TBST清洗10 min×5次，ECL化學(xué)發(fā)光。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，t檢驗(yàn)分析各組ALEX1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增ALEX1PCR成功擴(kuò)增出ALEX1序列的DNA片段，電泳可見大小約1 362 bp的特異性條帶(圖1)。

2.2重組質(zhì)粒LV5-ALEX1的鑒定將PCR產(chǎn)物與經(jīng)NotⅠ和NsiⅠ內(nèi)切酶線性化的LV5載體連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取質(zhì)粒酶切鑒定，酶切后產(chǎn)生了約1 500 bp的片段，片段大小與ALEX1基因cDNA大小一致(圖2)。

2.3LV5-ALEX1測序結(jié)果酶切鑒定正確的質(zhì)粒取10 μl送上海生工基因測序。測序結(jié)果與預(yù)期ALEX1基因序列完全一致，測序證實(shí)獲取重組質(zhì)粒V-ALEX1。

2.4慢病毒滴度測定的結(jié)果病毒滴度釆用逐孔稀釋法檢測，利用1、0.1和0.01 μl的慢病毒懸液分別感染293T細(xì)胞(1×104/孔)，72 h后觀察細(xì)胞熒光情況(圖3)。流式細(xì)胞儀檢測0.01 μl慢病毒懸液感染的293T細(xì)胞，其中GFP陽性細(xì)胞比率為42.5% (圖4)。經(jīng)計(jì)算，慢病毒滴度為104×42.5%/(0.01×10-3ml)=4.25×108TU/ml。

圖1　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析結(jié)果Fig.1　Gel electrophoresis of PCR productNote: 1.ALEX1；2.Marker.

圖2　NotI/NsiI酶切重組質(zhì)粒鑒定圖Fig.2　Map of recombinant plasmids digested by NotⅠ/NsiⅠNote: 1.ALEX1；2.Marker.

2.5LV5-ALEX1載體及對(duì)照載體感染SK-BR3細(xì)胞的效率將成功包裝的ALEX1過表達(dá)慢病毒載體(LV5-ALEX1)和陰性對(duì)照載體(LV5-NC)，感染SK-BR3細(xì)胞(MOI為10)，72 h熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效率達(dá)到90%左右(圖5)。

2.6LV5-ALEX1載體及對(duì)照載體感染SK-BR3 細(xì)胞后ALEX1的表達(dá)利用Real-time PCR和Western blot檢測ALEX1的表達(dá)變化(P<0.01) (圖6，7)，Real-time PCR和Western blot數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：

圖3　慢病毒LV5-ALEX1感染293T細(xì)胞(×100)Fig.3　Lentivirus LV5-ALEX1 infection in 293T cells(×100)

圖4　流式細(xì)胞術(shù)檢測慢病毒LV5-ALEX1的滴度Fig.4　Titer of lentivirus LV5-ALEX1 detected by flow cytometry

圖5　慢病毒LV5-ALEX1感染乳腺癌細(xì)胞的效率(×200)Fig.5　Efficiency of LV5-ALEX1 infection in breast cancer cells (×200)

圖6　Real-time PCR檢測ALEX1mRNA表達(dá)水平Fig.6　ALEX1 mRNA expression detected by real-time PCRNote: LV5-ALEX1 vs.LV5-NC,*.P<0.01.

圖7　Western blot檢測ALEX1蛋白表達(dá)水平Fig.7　ALEX1 protein expression detected by western blotNote: 1.LV5-NC;2.LV5-ALEX1.

與感染LV5-NC的SK-BR3細(xì)胞相比，LV5-ALEX1感染可明顯增加ALEX1在SK-BR3細(xì)胞mRNA和蛋白表達(dá)水平。

3討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，改變基因表達(dá)水平的方法和手段日趨成熟。目前，利用慢病毒載體導(dǎo)入外源性基因的方法遠(yuǎn)比普通質(zhì)粒應(yīng)用脂質(zhì)體導(dǎo)入目的基因的手段更具轉(zhuǎn)染效率高及表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)因而備受學(xué)者青睞[6]。慢病毒載體是將人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)的全部HIV-1編碼基因刪除進(jìn)而改造成的病毒載體系統(tǒng),能高效地將目的基因?qū)胝婧松锛?xì)胞中并隨著細(xì)胞不斷分裂持久且穩(wěn)定地表達(dá)目的基因[7]。本研究采用上海吉瑪公司提供的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)。即1個(gè)穿梭質(zhì)粒(LV5)和3個(gè)包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)。其中，穿梭質(zhì)粒中包含目的基因的慢病毒骨架及其包裝產(chǎn)生相應(yīng)基因組RNA的所有順式作用元件，可以穩(wěn)定表達(dá)目的基因。另外，三個(gè)輔助包裝質(zhì)粒可以提供病毒包裝所需的反式作用因子，采用“自我滅活”修飾，阻止子代病毒自我復(fù)制，從而確保慢病毒具備良好的生物安全性。

ALEX 蛋白是Arm蛋白家族的成員之一，因具有一或二個(gè)Arm repeat結(jié)構(gòu)不同于經(jīng)典的Arm蛋白具有的6～13個(gè)Arm repeat結(jié)構(gòu)而被單獨(dú)列為ALEX蛋白家族。其家族成員包括ALEX1，ALEX2和ALEX3[2,8,9]?；虮磉_(dá)分析顯示ALEX1 mRNA在人類多種正常組織中高表達(dá)而在上皮組織來源的癌組織低表達(dá)或不表達(dá)[1]。除此之外，Hiroyoshi Iseki 等[3,10]于2010年和2012年先后報(bào)道ALEX1基因受CREB和Wnt/β-catenin 通路調(diào)節(jié)并能夠抑制人直腸癌細(xì)胞的克隆形成。這些結(jié)果均表明ALEX1基因在上皮來源的腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。 目前，ALEX1在乳腺癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制仍不清楚。

為了使ALEX1基因能夠在乳腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了ALEX1過表達(dá)慢病毒。我們利用PCR擴(kuò)增得到目的基因ALEX1，利用T4 DNA連接酶將線性化的LV5載體和目的基因ALEX1連接，通過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取，重組慢病毒質(zhì)粒酶切鑒定和DNA測序最終鑒定重組質(zhì)粒V-ALEX1構(gòu)建成功。在包裝質(zhì)粒輔助下，利用293T細(xì)胞成功包裝成ALEX1的過表達(dá)慢病毒載體(LV5-ALEX1)和相應(yīng)的對(duì)照載體(LV-NC)。隨后利用上述病毒載體感染SK-BR3細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)慢病毒LV5-ALEX1能高效地感染SK-BR3細(xì)胞，real-time PCR 和western blot 顯示LV5-ALEX1能顯著增加ALEX1 mRNA 和蛋白水平的表達(dá)。這些結(jié)果說明包裝的重組慢病毒載體LV5-ALEX1能有效介導(dǎo)ALEX1的過表達(dá)，為接下來研究過表達(dá)ALEX1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及其分子機(jī)制奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[收稿2015-03-02修回2015-06-04]

(編輯許四平)

Construction and identification of ALEX1-gene-over-expressed lentivirus vector

GAOYue,DENGXiao-Fang,LEIJi-Kui.

DepartmentofClinicalLaboratory,theChineseTraditionalMedicineHospitalofBeibeiDistrict,Chongqing400700,China

[Abstract]Objective:To construct ALEX1-gene-over-expressed lentivirus vector and study expression of ALEX1 in SK-BR3 breast cancer cells after transfection,which is conducive to studying the function of ALEX1 in breast cancer.Methods: The ALEX1 gene was inserted into plasmid LV5 of lentiviral vector by recombinant DNA technology.Lentivirus vector V-ALEX1 was got after recombination.The combinant lentivirus vector was detected by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.The recombinant lentiviral plasmid V-ALEX1 was transfected into 293T cells with the packaging plasmids including pGag/Pol,pRev and pVSV-G by Lipofecta mine 2000.The recombinant lentivirus expressing ALEX1 was obtained from the cells supernatant and the viral titer was tested by flow cytometry.The ALEX1-gene-over-expressed recombinant lentivirus (LV5-ALEX1) and negative control recombinant lentivirus (LV5-NC) were transfected into SK-BR3 cells.The expression of ALEX1 was detected by real-time PCR and western blot.Results: The results of recombinant plasmids digestion identification showed that the fragment is about 1 500 bp,which is the same size as ALEX1 gene cDNA fragments.The blast results of ALEX1 cDNA sequence showed that the sequencing results and expected ALEX1 gene sequence is completely consistent.It was confirmed that the ALEX1 was correctly inserted into the vector,and that ALEX1-gene-over-expressed lentivirus vectors was successfully constructed.After packing 293T cells,we successful got recombinant lentivirus LV5-ALEX1 with virus drops to 4.25×108 TU/ml.The results of real-time PCR and western blot showed that the expression of ALEX1 was significantly upregulated in mRNA and protein levels in LV5-ALEX1 group campared with LV5-NC group in SK-BR3 cells.Conclusion: The lentiviral vector over-expressing ALEX1 gene was successfully constructed,and lentivirus can transfect SK-BR3 cells and exnous gene was expressed stably.

[Key words]ALEX1;Lentivirus;Construction;Identification

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.017

作者簡介：高月(1974年-)，女，博士，主要從事腫瘤分子生物學(xué)方面的研究，E-mail:moon19740000@163.com。

中圖分類號(hào)R329.26；R329.28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0678-04

①本文為遼寧省科技廳項(xiàng)目(2015020353)。