李磊，李海暢，高婧，周貽兵（.貴州省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生監(jiān)測檢驗所，貴州貴陽550004；.貴陽市疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽55000）

?

QuEChERS EMR- Lipid- LC/MS/MS測定8種β-受體激動劑

李磊1，李海暢2，高婧1，周貽兵1
（1.貴州省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生監(jiān)測檢驗所，貴州貴陽550004；2.貴陽市疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550002）

摘要：建立以QuEChERS EMR-Lipid為前處理測定動物源性食品中8種β-受體激動劑的LC-MS/MS方法。樣品經(jīng)粉碎混勻后加入pH為5.2乙酸-乙酸銨溶液，以β-鹽酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，酶解液經(jīng)QuEChERS EMR-Lipid凈化后，取乙腈層與0.1%的甲酸水溶液混合上LC-MS/MS進(jìn)行分析。8種β-受體激動劑在測定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各組分相關(guān)系數(shù)R2＞0.998，加標(biāo)回收率范圍79.1%～94.8%，方法精密度范圍5.4%～9.4%，測定各組分β-受體激動劑檢出限范圍0.2μg/kg～0.4μg/kg，定量限范圍0.5μg/kg～1.0μg/kg。

關(guān)鍵詞：β-受體激動劑；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；QuEChERS；脂質(zhì)去除；肉制品

β-受體激動劑又名瘦肉精，是一類人工合成藥物，具有營養(yǎng)在分配作用，可明顯提高瘦肉率，上世紀(jì)中期曾被廣泛添加于畜禽類飼料中［1-2］。人體攝入含有β-受體激動劑的動物組織將會出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、惡心、眩暈和緊張等癥狀［3］。我國在2002年將β-受體激動劑列入《食用動物禁用獸藥及其他化合物清單》［4］。然而在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，依然存在β-受體激動劑濫用的問題。

目前對于肉制品中β-受體激動劑的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法［5-6］、液相色譜法［7］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［8-9］。氣相色譜-質(zhì)譜法由于需要進(jìn)行衍生后測定，操作過程復(fù)雜，不適用于多種目標(biāo)物同時分析。液相色譜法使用保留時間進(jìn)行定性，由于肉制品基質(zhì)復(fù)雜，容易受到基質(zhì)干擾出現(xiàn)假陽性結(jié)果。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法特異性強(qiáng)、靈敏度高，是現(xiàn)階段測定β-受體激動劑的首選方法，但是由于其前處理過程主要依賴于固相萃取法進(jìn)行凈化，操作過程復(fù)雜，分析成本高昂。本文在已有研究基礎(chǔ)上，使用增強(qiáng)型脂質(zhì)快速凈化（QuEChERS EMR-Lipid）前處理方法對肉制品進(jìn)行凈化后測定8種β-受體激動劑，極大簡化了前處理方法，降低了分析成本，為β-受體激動劑的檢測提供了新的思路。

1　材料與方法

1.1主要儀器

TSQ Quantum三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、戴安U3000超高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技有限公司；QuEChERS dSPE EMR-Lipid、QuEChERS Final Polish EMR-Lipid：安捷倫科技有限公司；3-30KS離心機(jī)：德國Sigma公司；SB25-12YDTD超聲水浴鍋：寧波新芝生物科技公司；UP1600超純水機(jī)：艾普科技公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)品及試劑

標(biāo)準(zhǔn)品非諾特羅、福莫特羅、克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、妥布特羅、異丙喘寧（純度≥95.5%）：購自Dr.Ehrenstorfer公司；β-鹽酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶：購自德國sigma公司；甲醇、甲酸（HPLC純）：購自美國Fisher公司；乙腈（HPLC純）：購自德國Merck公司；乙酸銨、乙酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3樣品前處理

稱取粉碎混勻后的樣品2.0 g，于50 mL離心管中，加入0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH 5.2）10 mL，加入β-鹽酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶20 μL，漩渦混勻后于37℃下過夜酶解。將酶解后樣品漩渦混勻，4℃下10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液于增強(qiáng)型脂質(zhì)快速凈化管中（QuEChERS dSPE EMRLipid）并加入5 mL乙腈漩渦混勻2 min，靜置1 min后于7 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液加入脂質(zhì)凈化反萃取管中（QuEChERS Final Polish EMR-Lipid），漩渦混勻1 min后于5 000 r/min離心5 min。取上層乙腈0.5 mL與0.1%甲酸水0.5 mL混合后過0.45 μm濾膜，LC-MS/MS檢測。

1.4超高效液相色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1超高效液相色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil Gold（200 mm×2.1 mm，1.9 μm）（Thermo Fisher公司）；進(jìn)樣量10 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃。梯度進(jìn)樣程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution conditions

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+模式）；多反應(yīng)監(jiān)測MRM模式；噴霧電壓正離子模式3 000 V；離子源溫度320℃；脫溶劑溫度270℃；鞘氣（N2）40 arb；輔助氣（N2）8 arb。質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。

表2　質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass condition

2　結(jié)果與討論

2.1 QuEChERS EMR-Lipid與固相萃取小柱凈化效果對比

由于肉制品基質(zhì)成分復(fù)雜，測定動物源性食品β-受體激動劑前必須經(jīng)過除脂凈化后才能進(jìn)行質(zhì)譜分析，而目前凈化方法主要依賴于固相萃取法來完成［8-9］。固相萃取法作為前處理的經(jīng)典方法，雖然有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)，但是操作過程繁瑣，材料和時間成本都相對較高，且在上樣及淋洗過程中容易產(chǎn)生吸附不完全而導(dǎo)致穿透使分析目標(biāo)物損失。QuEChERS EMR-Lipid方法作為QuEChERS的改良方法，不僅具有QuECh－ERS快速、易操作的特點，對于質(zhì)譜分析還具有高效的凈化能力。在實際應(yīng)用中對比兩種前處理方法的加標(biāo)回收率測定結(jié)果見表3。

表3　不同前處理方法加標(biāo)回收率結(jié)果（n = 6）Table 3 Results of recoveries of different pretreatment methods

續(xù)表3　不同前處理方法加標(biāo)回收率結(jié)果（n = 6）Continue table 3 Results of recoveries of different pretreatment methods

2.2酶解提取條件與QuEChERS凈化條件的選擇

QuEChERS EMR-Lipid法在測定動物源性食品中多殘留時，使用乙腈進(jìn)行直接提?。?0］，但β-受體激動劑在動物體內(nèi)多以結(jié)合態(tài)形式存在，在提取前應(yīng)進(jìn)行酶解使得結(jié)合態(tài)的β-受體激動劑變?yōu)橛坞x態(tài)才能獲得較高提取效率。筆者利用0.2 mol/L乙酸銨-乙酸溶液（pH 5.2）中的β-鹽酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶破壞苯酚類、間苯二酚類β-受體激動劑苯環(huán)上的羥基結(jié)合位點，使β-受體激動劑由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離形態(tài)后，改良了QuEChERS EMR-Lipid操作，使得提取效率極大提高。

2.3色譜條件優(yōu)化

樣品經(jīng)過EMR-Lipid Polish反萃后，直接使用乙腈層上機(jī)分析發(fā)現(xiàn)峰形出現(xiàn)分叉現(xiàn)象，考慮到方法靈敏度及峰形的尖銳、對稱，筆者將0.5 mL反萃后的乙腈與0.5 mL的0.1%甲酸水進(jìn)行混合后上機(jī)測定，最終樣品測定峰形見圖1、圖2。

2.4質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜優(yōu)化采用微量進(jìn)樣泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行，將8種β-受體激動劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 ng/mL）進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，確定各個組分準(zhǔn)分子離子，優(yōu)化噴霧電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、鞘氣、輔助氣條件，使8種β-受體激動劑母離子綜合響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最佳。將獲得的母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，分別優(yōu)化8種β-受體激動劑的碎片離子，對碰撞能量、透鏡電壓進(jìn)行優(yōu)化，選擇豐度較高的兩個碎片離子作為定性和定量離子。

圖2　樣品中萊克多巴胺、克倫特羅、福莫特羅、妥布特羅選擇反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描圖譜Fig.2 Rackdopamine，clenbuterol，formoterol，tulobuterol of samples MRM scan results

2.5方法線性及檢出限

將空白基質(zhì)樣品，按照方法1.3進(jìn)行處理，取乙腈層0.5 mL，另取8種β-受體激動劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL混勻后配置成基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以響應(yīng)強(qiáng)度的峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（μg/L）作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)系列曲線，線性方程見表3。將線性范圍最低濃度點稀釋并上機(jī)測定，以3倍信噪比（S/N）響應(yīng)時所對應(yīng)的濃度（μg/kg）作為檢出限，以10倍信噪比（S/N）響應(yīng)時所對應(yīng)的濃度（μg/kg）作為定量限，結(jié)果見表3。

表3　8種β-受體激動劑線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Linear equation，correlation coefficient，LOD and LOQ of 8 β-agonists

2.6方法回收率及精密度

選擇豬肉、豬肝樣品以低、中、高3個濃度進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，低、中、高組加標(biāo)回收試驗分別添加10、50、100 μg/kg質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照1.3所述樣品前處理方法進(jìn)行處理后測定加標(biāo)回收率，平行測定6組，考察方法精密度，結(jié)果見表4。試驗結(jié)果顯示各種β-受體激動劑的回收率范圍為79.1%～94.8%，精密度范圍為5.4%～9.4%。

3　結(jié)論

本文建立了以QuEChERS EMR-Lipid為前處理方法，并運(yùn)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定肉制品中8種β-受體激動劑的方法。該方法相對于固相萃取前處理方法，具有操作簡單，有較高的基質(zhì)干擾消除能力，方法準(zhǔn)確度、靈敏度高，能夠滿足肉制品中β-受體激動劑的檢測要求。

表4　8種β-受體激動劑加標(biāo)回收率及精密度（n = 6）Table 4 Recoveries and RSD of 8 β-agonists（n = 6）

參考文獻(xiàn)：

［1］丁煥中，陳杖榴，楊志凌.營養(yǎng)重分配劑萊克多巴胺的藥理作用和應(yīng)用［J］.獸藥與飼料添加劑，2002，7（1）：18-20

［2］劉先軍，王一紅，李幫銳，等.超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動物組織中26種β-受體激動劑［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2015，27 （3）：265-270

［3］Wagner S A，Mostrom M S，Hammer C J，et al. Adverse effects of zilpaterol administration in horses：three cases［J］. J Equine Vet Sci，2008，28：238-243

［4］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單（農(nóng)業(yè)部第193號公告）［Z］. 2002

［5］甘平勝，朱惠揚(yáng)，于鴻，等. GC-MS法測定動物性食品中15種興奮劑殘留量［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22（11）：2544-2545，2549

［6］林維宣，田苗，董偉峰.固相萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法同時檢測動物組織中多種β-興奮劑殘留量的研究［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（Z1）：1-4

［7］蘇文周，蔡玉枝，羅曉燕.高效液相色譜法測定豬尿中鹽酸克倫特羅［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2001，11（4）：436-437

［8］苗虹，鄒建宏，范賽，等.高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜法測定尿液中β2-受體激動劑及β-受體阻斷劑［J］.色譜，2010，28（6）：572-578

［9］李磊，周貽兵，林野，等.超高效液相色譜-質(zhì)譜法同時測定肉制品中8種β-受體激動劑［J］.貴州師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，32（2）：99-103

［10］申海鵬，任羽紅. Agilent Bond Elut QuEChERS EMR-Lipd：樣品前處理中去除脂質(zhì)的利器［J］.食品安全導(dǎo)刊，2015，25（8）：26-29

Determination of 8 β-Agonists by QuEChERS EMR-Lipid-LC/MS/MS

LI Lei1，LI Hai-chang2，GAO Jing1，ZHOU Yi-bing1

（1. Clinical Laboratory，Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China；2. Guiyang Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550002，Guizhou，China）

Key words：β-agonists；LC-MS/MS；QuEChERS；EMR-Lipid；meat

Abstract：A method with QuEChERS EMR-Lipid pretreatment for the determination of 8 β-agonists in animal tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）was established. The crushed sample was added to sodium acetate（pH 5.2）and enzymatic hydrolysis by β-Glucuronidase/Arysulfatase. The sample was purified by QuEChERS EMR-Lipid and took the acetonitrile mixed with 0.1%formic acid solution，then detected by LC-MS/MS. The 8 kinds of β-agonists showed good linear relationship between the concentration range，components correlation coefficient R2＞0.998，standard addition recovery range between 79.1%-94.8%，precision range 5.4%-9.4%，LOD components range 0.2 μg/kg-0.4 μg/kg and LOQ components range 0.5 μg/kg-1.0 μg/kg.

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.042

作者簡介：李磊（1986—），男（漢），主管技師，碩士研究生，從事環(huán)境及食品衛(wèi)生檢驗。

收稿日期：2016-02-22