(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院中心實驗室,陜西西安 710038)

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·論著·

Stathmin基因畢赤酵母表達體系的構建及鑒定*

(第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院中心實驗室,陜西西安 710038)

摘要:目的構建Stathmin基因畢赤酵母表達體系，并對表達產物進行純化和鑒定，為Stathmin相互作用蛋白的進一步研究提供實驗基礎。方法通過PCR方法從SKBR3乳腺癌細胞中擴增出人Stathmin基因片段，克隆入畢赤酵母表達載體pPIC3.5K，構建重組載體pPIC3.5K-Stathmin，轉化GS115工程菌，經含基因素(G418)的酵母膏胨葡萄糖瓊脂(YPD)培養(yǎng)基篩選出陽性克隆。用0.5%甲醇誘導表達，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及Western Blotting鑒定表達產物。結果DNA測序結果表明，所獲基因片段與Stathmin基因序列一致。在含有G418 600 μg/mL的YPD培養(yǎng)基上篩選出的pPIC 3.5K-Stathmin轉化子，經PCR鑒定為陽性克隆。SDS-PAGE可見約 37×103處有目的條帶表達，經Western Blotting鑒定，此條帶為Stathmin蛋白。結論成功構建了Stathmin酵母表達載體，并在畢赤酵母中表達成功，為Stathmin相互作用蛋白研究以及生物治療藥物的制備奠定了基礎。

關鍵詞:基因；畢赤酵母表達體系；鑒定

Stathmin是一種高度保守的細胞質磷蛋白，通過其磷酸化和去磷酸化高效調節(jié)細胞的增殖和分化[1]。國內外研究均表明Stathmin蛋白與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[2-4]，并與腫瘤組織學分級、病情進展以及預后相關[5]。Stathmin被認為是潛在的腫瘤標志物和腫瘤治療新靶點[6]。為進一步深入探討以Stathmin為靶點的應用研究，Stathmin表達體系的建立至關重要，而原核表達體系雖然周期短、表達產量高，但目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產物純化困難，且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低，不能滿足進一步研究的需要。所以研究者構建了Stathmin畢赤酵母真核表達體系，純化His-Stathmin蛋白，為發(fā)現(xiàn)新的Stathmin拮抗蛋白和新的腫瘤生物治療藥物奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料pPIC3.5K載體和pichia host strain購自Invitrogen公司。E.coliJM109為本實驗室保存。限制性內切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ、Tap DNA聚合酶、T4DNA連接酶，均購自Takara公司。Anti-His抗體購自中衫金橋公司，Anti-Stathmin抗體購自cell singaling公司，其他常規(guī)試劑為本實驗室保存。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；引物序列如下：Stathmin-F：5′-TTT TCC TTT TGC GGC CGC TTA GTC AGC TTC AGT CTC G -3′，其中下劃線部分為Notc酶切位點； Stathmin-R：5′-CG GAA TTC CAC CAC CAC CAC CAC CAC ATG GCT TCT TCT GAT-3′，其中下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點，波浪線部分為His標簽。

1.2方法

1.2.1Stathmin基因片段擴增根據GeneBank(X53305)人Stathmin基因序列，設計合成用于擴增Stathmin全長基因的Stathmin-F,Stathmin-R引物，提取乳腺癌細胞系SKBR3細胞總RNA,反轉錄為cDNA模板，常規(guī)PCR方法擴增Stathmin全長基因。反應體系按照說明書進行，PCR反應條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

1.2.2重組pPIC3.5K質粒建立用EcoRⅠ和NotⅠ分別雙酶切全長Stahtmin基因片段及pPIC3.5K載體37 ℃，4 h。瓊脂糖電泳后分別回收目標片段并純化。將Stathmin基因克隆入pPIC3.5K載體相應位點，用氯化鈣法轉化入E.coli JM109感受態(tài)，挑取菌落，提取質粒，經雙酶切和PCR鑒定，篩選陽性克隆命名為pPIC3.5K-Stathmin并且進行基因測序，確定沒有突變。

1.2.3酵母感受態(tài)的制備 挑取酵母菌GS115于100 mL酵母膏胨葡萄糖瓊脂(YPD)培養(yǎng)基中，28 ℃，250 r/min培養(yǎng)16 h，待OD值達1.0～1.5，4 000 r/min，5 min，4 ℃離心集菌。沉淀用50 mL預冷滅菌水洗滌1次，再用20 mL預冷1 mol山梨醇洗滌1次后，用1 mL山梨醇重懸后冰浴。制備成酵母菌GS115感受態(tài)。

1.2.4Stathmin酵母表達載體的構建重組質粒pPIC3.5K-Stathmin用Sal1內切酶線性化處理，電轉化法轉入GS115感受態(tài)后，涂布于MD平板，28 ℃培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)出的克隆稀釋后涂布到含有G418分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL的YPD平板，28 ℃孵育2～3 d，篩選出高拷貝克隆。挑取單克隆至MGY液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h后提取酵母菌基因組DNA，用PCR鑒定Stathmin與酵母基因組是否整合成功。

1.2.5甲醇誘導表達及鑒定取PCR鑒定陽性克隆接種于5 mL BMGY培養(yǎng)液中，于28 ℃培養(yǎng)18 h，至OD600為2.0～6.0時，2 000 r/min離心5 min集菌，用適量BMMY培養(yǎng)液重懸，使OD600值在1.0～1.2。加入甲醇溶液誘導表達，使甲醇總濃度維持在0.5%，每24 h補充1次甲醇。培養(yǎng)96 h后，用Western Blotting對表達產物進行鑒定，并以pPIC3.5K空載體為陰性對照。

1.2.6Stathmin蛋白的純化和鑒定采用Anti-His-tag親和層析柱對Stathmin蛋白進行純化。收集誘導表達的畢赤酵母，加液氮研磨破壁20 min，用1 mL PBS進行重懸，4 000 r/min離心5 min后，取上清14 000 r/min離心4 min，再用0.45 nm濾膜過濾后，加入Anti-His-tag親和層析柱進行純化，收集流穿液。用5倍床體積PBS進行洗柱后，再用50、100、150、200 mmol/L咪唑分別進行洗脫。并將洗脫液收集，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blotting對Stathmin蛋白進行鑒定。

2結果

2.1Stathmin基因片段擴增結果以乳腺癌SKBR3細胞cDNA為模板，PCR擴增Stathmin基因片段，經瓊脂糖凝膠電泳，可見一條約450 bp的片段，與預期Stathmin基因片段大小符合，見圖1。

2.2重組pPIC3.5K-Stathmin質粒的鑒定重組質粒經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳，可見一條9 000 bp和一條450 bp的條帶，符合預期，見圖2。陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序鑒定結果顯示序列正確，與Genebank X53305一致，見圖3(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網站主頁“論文附件”)。

M:DNA標志物DL2000；1:Stathmin PCR產物。

圖1瓊脂糖凝膠電泳Stathmin基因片段PCR擴增結果

M:DNA標志物DL2000；1:pPIC3.5K-Stathmin。

圖2pPIC3.5K-Stathmin重組表達載體的雙酶切鑒定結果

2.3重組畢赤酵母菌的構建、篩選和鑒定在含有0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL不同梯度G418的YPD固體培養(yǎng)基上抗性篩選畢赤酵母轉化子，提取基因組DNA為模板，進行PCR鑒定，出現(xiàn)預期450 bp的條帶,見圖4。

M:DNA標志物DL2000；1:pPIC3.5K空載體；2～6:分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL G418 YPD 篩選的pPIC3.5K-Stathmin轉化子。

圖4pPIC3.5K-Stathmin重組轉化的

畢赤酵母的PCR鑒定

2.4目的蛋白的純化和鑒定采用Anti-His-tag親和層析柱對表達的Stathmin蛋白進行純化。經SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，凝膠上出現(xiàn)相對分子質量約為35×103的條帶,見圖5。分別用His抗體和Stathmin抗體進行Western Blotting鑒定，分別在膠片上同樣相對分子質量大小出現(xiàn)條帶，蛋白鑒定為Stathmin蛋白。相對分子質量較預期19×103偏大，與添加His標簽和蛋白糖基化有關，空載體轉化的畢赤酵母菌作為陰性對照，沒有出現(xiàn)相應條帶，見圖6。

M:蛋白質標志物；1:培養(yǎng)液上清;2:上樣液;3:流穿液;4:PBS洗脫液;5～8:分別為50、100、150、200 mmol/L咪唑洗脫液;9:PBS洗脫液。

圖5SDS-PAGE 鑒定表達和純化的Stathmin蛋白

1:陽性對照；2:陰性對照；3:Stathmin蛋白。

圖6Western Blotting鑒定Stathmin蛋白

3討論

Stathmin是一種由149個氨基酸殘基組成的可溶性、高度保守的細胞質磷蛋白。它的相對分子質量約為19×103，分為2個區(qū)域。一個是N端的“磷酸化”區(qū)域，其含有Ser16、Ser25、Ser38和Ser63共4個絲氨酸磷酸化位點[7]。另一個是C端的“功能”區(qū)域，該區(qū)域可以和微管的α/β異源二聚體螯合形成緊密的T2S三聚體復合物，從而調節(jié)微管蛋白的功能[8]。該蛋白廣泛存在于各種脊椎動物細胞中，主要通過與微管系統(tǒng)作用發(fā)揮功能，Stathmin蛋白作為一種基本的微管解離蛋白，通過結合微管蛋白參與微管和紡錘體的組裝和活化調節(jié)。此外，Stathmin不僅能和多種其他蛋白結合，也是許多細胞內蛋白激酶的底物,Stathmin還在不同的細胞周期通過修飾Stathmin蛋白的不同磷酸化位點而改變微管蛋白的聚合從而調控細胞的增殖、分化和運動[9-11]；同時，許多癌基因及抑癌基因的表達產物，還有大量的細胞因子均可通過不同的方式與Stathmin作用而引起腫瘤細胞生物學行為的改變。另外，Stathmin可以作為信號轉導子，參與信號通路活性調節(jié)，在細胞的生長發(fā)育過程中發(fā)揮了非常重要的作用。Stathmin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，作為潛在的腫瘤標志物和新的腫瘤生物治療靶點，Stathmin蛋白表達系統(tǒng)的建立對進一步研究腫瘤靶向治療藥至關重要。

畢赤酵母表達系統(tǒng)與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母作為單細胞真核生物，不但具有原核生物生長快速、培養(yǎng)基廉價和實驗手段簡單等特點，還具備真核生物可對表達蛋白進行加工折疊和翻譯后修飾等生物學特性，并且克服了原核表達系統(tǒng)表達產物多以包涵體形式存在，復性困難且效率低下，背景蛋白多、不易純化的缺點。而相較釀酒酵母表達體系，畢赤酵母具有更強有力的啟動子、分泌效率有所提高，表達質粒更穩(wěn)定等特性。并且還具有可以通過高密度發(fā)酵獲得大量產物，且分泌產物無過度糖基化，臨床應用安全等特點[12]。本研究使用pPIC3.5K載體構建Stathmin畢赤酵母表達體系，使用的醇氧化酶基因(AOX)啟動子為強誘導型啟動子，可有效地調控外源基因的高效表達。在Stathmin蛋白上加入了6×His-tag表達標簽，用優(yōu)質帶鎳離子的親和純化柱進行純化，目標蛋白純度高，方法簡單。

構建Stathmin畢赤酵母表達體系，純化Stathmin蛋白，將有利于發(fā)現(xiàn)Stathmin蛋白的拮抗蛋白或多肽，為新的腫瘤生物治療靶向藥物的產生奠定基礎。同時，也可以更好地研究Stathmin 蛋白與其他蛋白相互作用關系以及Stathmin在信號通路中的作用，進一步深入地了解Stathmin在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。Stathmin 作為新的腫瘤標志物和腫瘤生物治療新靶點，將發(fā)揮更加重要的作用，成功構建Stathmin畢赤酵母表達體系為Stathmin的進一步研究奠定重要基礎。

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Construction and identification of Stathmin gene Pichia pastoris expression system*

YangMing,LinFang,HeTing,DongKe,ZhangHuizhong△

(CentralLaboratory,TangduHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710038,China)

Abstract:ObjectiveTo provide the experimental basis for the further research of the interacting proteins with Stathmin，the Stathmin gene Pichia pastoris expression system was constructed，the expressed Stathmin product was purified and identified.MethodsStathmin gene was amplified from tumor cell line of SKBR3 by PCR method and cloned into the yeast expression vector pPIC3.5K.The recombinant vector pPIC3.5K-Stathmin was constructed and transformed into Pichia pastoris GS115.The positive clones were screened by YPD medium containing Geneticin 600 μg/mL.Expression was induced with 0.5% methanol and expression products were identified by SDS-PAGE and Western Blotting.ResultsDNA sequencing result showed that the gene fragment was consistent with Stathmin gene sequence.pPIC3.5K-Stathmin was selected from YPD culture medium containing Geneticin,and the positive clones were identified by PCR.SDS-PAGE showed that a 37×103 protein band could be seen on the PAGE gel after Coomassie Blue staining,which was further confirmed and identified as Stathmin protein by Western Blotting.ConclusionStathmin yeast expression vector is successfully constructed and expressed in Pichia pastoris,which laid the foundation for the study of interacting proteins with Stathmin,and for the preparation of the biological treatment drugs of Stahtmin target.

Key words:gene;Pichia pastoris expression system；identify

(收稿日期：2015-12-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.001

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1161-03

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(81372836)。

作者簡介：楊銘，女，檢驗技師，主要從事腫瘤生物治療研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：zhz328@yahoo.com.cn。

楊銘,林芳,和婷,董軻,張惠中△