李莉　陳紅耀　韓曉麗　賀麗亞　張洪珍

050051　石家莊市，河北省人民醫(yī)院中醫(yī)科(李莉),耳鼻喉科(陳紅耀、韓曉麗),腫瘤五科(賀麗亞、張洪珍)

?

·論著·

康萊特對Lewis肺癌小鼠TAM及E-cadherin、Vimentin表達(dá)的影響

李莉陳紅耀韓曉麗賀麗亞張洪珍

050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院中醫(yī)科(李莉),耳鼻喉科(陳紅耀、韓曉麗),腫瘤五科(賀麗亞、張洪珍)

【摘要】目的研究康萊特注射液(KLT)對腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM)及上皮間質(zhì)化的關(guān)鍵因子上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin, E-cad)、波形蛋白(Vimentin)的影響。方法建立小鼠肺癌Lewis細(xì)胞移植瘤模型，設(shè)對照組和康萊特低、中、高劑量組作為對照，分別給0.9%氯化鈉溶液:12.5 ml/kg、KLT:6.25、12.5、25 ml/kg，腹腔注射。稱取小鼠體重、瘤重及脾臟重量；流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測腫瘤組織中TAM比例；Western Blot檢測上皮相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物Vimentin蛋白的表達(dá)。結(jié)果KLT注射液低劑量組、中劑量組、高劑量組的抑瘤率分別為2.63%、41.59%和50.21%。KLT高、中劑量組的瘤重、脾臟指數(shù)、TAM比例、E-cadherin、Vimentin與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論康萊特對Lewis肺癌小鼠腫瘤的生長具有一定的抑制作用，可能是通過影響腫瘤微環(huán)境中TAM細(xì)胞的數(shù)量，改善上皮間質(zhì)化現(xiàn)象實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】康萊特；Lewis肺癌；TAM；E-cadherin、Vimentin

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤之首[1]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM)是腫瘤免疫微環(huán)境中數(shù)量最多的細(xì)胞群，它可降低腫瘤細(xì)胞細(xì)胞角蛋白、E鈣黏素(E-cadherin, E-cad)等上皮結(jié)構(gòu)黏附蛋白的表達(dá)，升高波形蛋白(Vimentin)等間葉組織標(biāo)記的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[2]，即上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。研究表明，在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中TAM和EMT起著不可忽視的作用[3]?？等R特注射液(KLT)是一種薏苡油合成的中藥制劑，主要提取自中藥薏苡仁，不但具有抗腫瘤作用，還可提高患者免疫力，甚至逆轉(zhuǎn)耐藥[4]?？鼓[瘤藥物康萊特有望通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，影響腫瘤微環(huán)境中TAM細(xì)胞的數(shù)量，改善腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而起到抗腫瘤的作用。本研究通過創(chuàng)建Lewis肺癌小鼠模型，研究康萊特注射液對瘤重、脾臟指數(shù)的影響及其對TAM比例、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器健康雄性昆明小鼠，5～6周齡，體重18～20 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心(動物合格證編號：1409008)，給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，不控制飲水，由河北省人民醫(yī)院臨研中心提供SPF級動物飼養(yǎng)室。Lewis肺癌細(xì)胞株購自河北醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?？等R特注射液(規(guī)格：100 ml，10 g/瓶)購自浙江康萊特藥業(yè)有限公司；四季青胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Gibco公司。PE-CD11b、FITC-F4/80 mAb購自美國 eBioscience 公司。鼠抗人E-Cadhering、Vimnetin單克隆抗體、SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Lewis小鼠模型的建立及分組干預(yù)：Lewis肺癌細(xì)胞株復(fù)蘇后傳代，取傳至3～4代生長良好的Lewis肺癌細(xì)胞，臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)活性>95%，配制細(xì)胞濃度為5×107個/ml的細(xì)胞懸液，0.2 ml/只注射于小鼠左前腋窩皮下。接種6～7 d后，小鼠左前腋皮下可觸及2～3 mm直徑硬結(jié)，移植瘤模型建立成功。隔日定時用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑a及最短徑b，待最長徑為0.8～1 cm時，舍棄腫瘤過大(ab>2.5 cm2)或過小(ab<0.20 cm2)的小鼠，挑選腫瘤大小較均一的荷瘤小鼠24只，隨機(jī)分為對照組、康萊特低劑量組、康萊特中劑量組、康萊特高劑量組，每組6只，腹腔注射相應(yīng)藥物，分別為：0.9%氯化鈉溶液12.5 ml/kg、KLT 6.25、12.5、25 ml/kg，2次注射之間間隔12 h，連續(xù)給藥14 d。處死小鼠，剪開小鼠腋下皮膚，完整剝離腫瘤及脾臟。

1.2.2計(jì)算腫瘤抑制率和脾臟指數(shù)：分別稱取小鼠體重、瘤重及脾臟重量，腫瘤抑制率=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。脾臟指數(shù)=脾臟重量(g)/小鼠體重(g)÷100。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測腫瘤組織TAM比例：將部分腫瘤組織機(jī)械法制備成細(xì)胞懸液，加入PE-F4/80+和FITC-CD11b+抗體各2 μl，用流式細(xì)胞儀檢測CD11b+F4/80+細(xì)胞含量。

1.2.4Western Blot檢測腫瘤組織E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)：剪取腫瘤組織0.25 g，嚴(yán)格按照RIPA蛋白裂解液試劑盒說明書提取總蛋白，加入上樣緩沖液然后煮沸樣品5 min使蛋白變性，置于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上之后，用5%脫脂奶粉配置的TBST室溫封閉2 h，加入一抗(兔抗E-cadherin單克隆抗體1∶800、兔抗Vimentin多克隆抗體1∶1 000)孵育，4℃封閉過夜，TBST洗膜后辣根過氧化酶二抗室溫孵育45 min，TBST洗膜15 min×3次，暗室ECL顯影。以β-Actin為內(nèi)參，測E-cadherin、Vimentin的蛋白表達(dá)，相對表達(dá)量為各蛋白與β-Actin顯影條帶灰度值的比值[5]。

2結(jié)果

2.1腫瘤抑制率和脾臟指數(shù)處死小鼠后，稱取瘤重。KLT注射液高、中劑量組的瘤重與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KLT低劑量組的瘤重與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KLT注射液高、中、低劑量組對腫瘤的抑制率分別為50.21%、41.59%和2.63%。KLT高、中、低劑量組的脾臟指數(shù)均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　KLT對腫瘤抑制率及脾臟指數(shù)的影響　±s

注：與對照組比較，*P<0.05

2.24組腫瘤組織TAM比例KLT注射液高、中、低劑量組均低于對照組，其中KLT高、中劑量組與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；KLT低劑量組與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)情況相比于對照組，E-cadherin在KLT高、中劑量組腫瘤組織中的表達(dá)增高，Vimentin蛋白的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KLT低劑量組腫瘤組織中E-cadherin、Vimentin蛋白與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2KLT對小鼠腫瘤組織中TAM比例的影響

組別TAM對照組7.32±0.03KLT高劑量組4.80±0.03*KLT中劑量組4.86±0.02*KLT低劑量組6.20±0.04

注：與對照組比較，*P<0.05

表3KLT對小鼠腫瘤組織中E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響

組別E-cadherinVimentin對照組0.37±0.030.38±0.03KLT高劑量組0.64±0.01*0.31±0.01*KLT中劑量組0.49±0.01*0.32±0.01*KLT低劑量組0.41±0.010.36±0.01

注：與對照組比較，*P<0.05

3討論

康萊特注射液提取自中藥薏苡仁，是經(jīng)現(xiàn)代先進(jìn)制藥工藝制成的一種具有抗癌活性的中藥制劑，其主要組分為中性油脂三酰甘油。研究表明康萊特注射液其對多種腫瘤細(xì)胞(肺、肝、腦、乳腺腫瘤等)均能有較強(qiáng)的殺傷及抑制作用[6]。

動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KLT作用于肝癌移植瘤小鼠后，可將腫瘤細(xì)胞阻斷在細(xì)胞周期的G2+M期，阻止部分細(xì)胞進(jìn)入G0和G1期，減少有絲分裂的細(xì)胞數(shù)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7]。Woo等[8]研究發(fā)現(xiàn)，康萊特注射液能夠具有抑制體內(nèi)外腫瘤生長的作用。本研究結(jié)果顯示康萊特高、中、低劑量組的瘤重低于對照組，表明康萊特對Lewis腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制及殺傷作用，從而減少腫瘤的局部復(fù)發(fā)。

KLT作用于癌細(xì)胞主要是將其停滯在G2-M期，減少有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，還能夠提高患者免疫力、改善生存質(zhì)量[9-11]。脾臟作為免疫器官，脾臟指數(shù)可當(dāng)作評價機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一。Pan等[12]研究KLT對免疫功能的調(diào)節(jié)活性，發(fā)現(xiàn)腹腔注射KLT顯著抑制Lewis肺癌細(xì)胞生長，KLT高低劑量組的脾臟指數(shù)顯著高于生理鹽水組。另有動物實(shí)驗(yàn)也顯示，與CTX組相比，康萊特各劑量組的脾、胸腺指數(shù)明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[13]。本研究結(jié)果顯示康萊特高、中、低劑量組的脾臟指數(shù)明顯低于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明康萊特注射液對Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫功能具有一定的保護(hù)作用。李莉等[14]研究發(fā)現(xiàn)給晚期肺癌患者應(yīng)用康萊特后，可提高CD3、CD4細(xì)胞活性，改善患者的免疫狀態(tài)。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞生存所處的微環(huán)境(腫瘤微環(huán)境)有關(guān)。腫瘤微環(huán)境包括癌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、生物因子以及免疫細(xì)胞等[15]。腫瘤微環(huán)境包括免疫微環(huán)境、炎癥微環(huán)境、酸性微環(huán)境、缺氧微環(huán)境等。

TAM主要包括M1(經(jīng)典活化型)、M2(替代活化型)及其他亞型[16]。M1型可引起Th1免疫反應(yīng)，對微生物和腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性；M2型具有免疫抑制作用，促進(jìn)血管生成、組織重塑和腫瘤進(jìn)展[17]。在腫瘤微環(huán)境中，TAM極化主要偏向M2表型[18]。研究顯示，TAM參與了腫瘤新生血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)降解，還介導(dǎo)了腫瘤免疫逃逸，從而參與并促進(jìn)了腫瘤發(fā)生、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移多個階段[19,20]。TAM最主要的分子標(biāo)記物CD68。

EMT是指受某些特殊生理或病理?xiàng)l件的影響，上皮細(xì)胞表型缺失并向成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，減弱細(xì)胞間的黏附作用，使細(xì)胞遷移和運(yùn)動能力增強(qiáng)的現(xiàn)象[21]。E-cadherin表達(dá)下調(diào)及Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)是EMT重要特征[22]。Vimentin表達(dá)于上皮性腫瘤細(xì)胞，研究表明，發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化時Vimentin蛋白過表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[23,24]。

本研究進(jìn)一步檢測了腫瘤組織TAM的比例及E-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)康萊特高、中、低劑量組的TAM比例及Vimentin蛋白表達(dá)均低于對照組，而E-cadherin蛋白表達(dá)高于對照組，且康萊特高、中劑量組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此結(jié)果說明Lewis肺癌小鼠應(yīng)用康萊特后，腫瘤組織中TAM比例降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高，而Vimentin蛋白表達(dá)降低，推斷康萊特注射液對腫瘤免疫微環(huán)境及上皮間質(zhì)化過程均有影響。

綜上所述，KLT注射液一定程度上可抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤的生長，其可能的機(jī)制與抑制腫瘤組織中的TAM，從而抑制微血管生成有關(guān)；上調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平，從而增加腫瘤細(xì)胞間的黏附能力有關(guān)；下調(diào)Vimentin表達(dá)水平，從而阻止腫瘤細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

1Rebecca Siegel, Jiemin Ma, Zhaohui Zou, et al. Cancer Statistics,2014.CA: A Cancer Journal for Clinicians,2014,6:9-29.

2Galdiero MR, Garlanda C, Jaillon S, et al. Tumor associated macrophages and neutrophils in tumor progression. Journal of cellular physiology,2013,228: 1404-1412.

3章必成,楊波,劉健,等. 小鼠肺癌移植瘤腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的表型鑒定. 臨床腫瘤學(xué)雜志,2011,16: 677-681.

4趙娜,魏素菊,洪雷,等. 康萊特注射液對吉非替尼誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞株凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究. 臨床腫瘤學(xué)雜志,2015,20: 1-7.

5夏丹, 李勇敏, 譚小寧, 等. 肺復(fù)康對Lewis肺癌小鼠腫瘤生長及E-cadherin、Vimentin和TGF-β表達(dá)的影響. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35: 30-33.

6張真發(fā). 康萊特在肺癌外科治療中的應(yīng)用. 中國腫瘤臨床,2012,39: 1155-1157.

7Wu LQ, Lu Y, Lu HJ, et al. Efficacy of intratumor injection of Kang-Lai-Te in treating transplanted hepatoma in rats. Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2004,3: 580-584.

8Woo JH, Li DP, Wilsbach K, et al. Coix Seed Extract, a Commonly Used Treatment for Cancer in China, Inhibits NFкB and Protein Kinase C Signaling Cancer. Bio&Thera,2007,6: 2005-2011.

9魏智勇, 韓旭鶴. 康萊特注射液的藥理作用與臨床評價.中草藥雜志,2009,40:1166-1168.

10徐曉衛(wèi), 林觀樣, 袁拯忠, 等. 康萊特聯(lián)合化療治療非小細(xì)胞肺癌的系統(tǒng)評價. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2014,32: 733-739.

11鄒春英, 呂培中, 王曉蓮, 等. 康萊特對老年肺癌患者外周血T淋巴細(xì)胞及亞群CD28表達(dá)的影響.江蘇醫(yī)藥,2011,37: 1768-1770.

12Pan P,Wu Y,Guo ZY,et al.Antitumor activity and immunomodulatory effects of the intraperitoneal administration of Kanglaite in vivo in Lewis lung carcinoma. Journal of Ethnopharmacology,2012,143: 680-685.

13張愛琴, 馬勝林, 孫在典,等. 康萊特注射液對Lew is肺癌小鼠免疫功能的影響. 浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,17: 199-200.

14李莉, 戴福生, 馬艷凱, 等. 康萊特注射液對老年飛小細(xì)胞肺癌患者生活質(zhì)量的影響. 河北中醫(yī),2012,34: 1691-1692.

15Andersen S, Donnem T, Stenvold H, et al. Overexpression of the HIF hydroxylases PHD1, PHD2, PHD3 and FIH are individually and collectively unfavorable prognosticators for NSCLC survival.PloS One,2011,6: e23847.

16Torroella-Kouri M, Silvera R, Rodriguez D, et al. Identification of a subpopulation of macrophages in mammary tumor-bearing mice that are neither M1 nor M2 and are less differentiated. Cancer Res,2009,69: 4800-4809.

17Mantovani A, Germano G, Marchesi F, et al. Cancer-promoting tumor-associated macrophages: new vistas and open questions. Eur J Immunol,2011,41: 2522-2525.

18Mantovani A, Sozzani S, Locati M, et al. Macrophage polarization:tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology,2002,23: 549-555.

19Steidl C, Lee T, Shah SP, et al. Tumor-associated macrophages and survival in classic Hodgkin's lymphoma.N Engl J Med,2010,362: 875-885.

20Liou P, Bader L, Wang AT, et al. Correlation of tumor-associated macrophages and clinicopathological factors in Wilms tumor.Vascular Cell,2013,5:5.

21Wang Y, Zhou BP. Epithelial-mesenchymal transition in breast cancerprogression and metastasis.Chin J Cancer,2011,30: 603-611.

22Lamouille S, Xu J, Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial mesenchymal transition. Nature reviews Molecular cell biology,2014,15: 178-196．

23Liu Z, Chen L, Zhang X, et al. RUNX3 regulates vimentin expression via miR-30a during epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer cells. J Cell Mol Med,2014,18: 610-623．

24Cheng CW, Wang HW, Chang CW, et al. MicroRNA-30a inhibits cell migration and invasion by downregulating vimentin expression and is a potential prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment,2012,134:1081-1093.

(收稿日期：2015-11-17)

【中圖分類號】R 730.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)10-1512-03

通訊作者:張洪珍，050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院腫瘤五科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.10.020

E-mail：hongzhenzhang456@sohu.com