譚從娥，馮文哲，陳金妍，楊　飛

(陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046)

?

論著

右歸丸對腎陽虛證患者TLR4/MyD88/NF-κB信號通路表達(dá)的影響

譚從娥，馮文哲，陳金妍，楊飛

(陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046)

[摘要]目的探討右歸丸治療腎陽虛證的免疫調(diào)控機(jī)制。方法篩選9例腎陽虛證患者,均給予右歸丸口服，連服1個月。分別于治療前后采集患者外周靜脈血，制備外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，提取RNA，按照實時定量PCR(qPCR)實驗流程，檢測TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表達(dá)情況，并進(jìn)行比較分析。結(jié)果治療后，患者TLR4mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P均<0.05)。結(jié)論右歸丸可以調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的表達(dá)，這可能是右歸丸良性調(diào)節(jié)腎陽虛證免疫功能的分子機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]腎陽虛證；右歸丸；TLR4/MyD88/NF-κB信號通路；實時定量PCR

腎陽虛證存在著免疫功能紊亂，這一結(jié)論已經(jīng)被不同層次的實驗研究所證實[1-2]。Toll受體(Toll-like receptor，TLR)信號通路在自身免疫中有重要作用，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁[3]，與中醫(yī)腎的免疫功能有著千絲萬縷的聯(lián)系。右歸丸是臨床治療腎陽虛證最常用的代表方劑，其可通過調(diào)控免疫細(xì)胞、免疫基因以及細(xì)胞內(nèi)信號傳遞通路等而發(fā)揮治療作用[4]。因此筆者推測，對TLR信號通路的調(diào)節(jié)作用可能是右歸丸良性調(diào)節(jié)腎陽虛證免疫功能失衡的分子機(jī)制之一。為了驗證此假說，本研究通過實時定量PCR(qPCR)技術(shù)，分析TLR4介導(dǎo)的MyD88/NF-κB信號通路在腎陽虛證患者經(jīng)右歸丸治療前后的表達(dá)情況，為右歸丸良性調(diào)節(jié)腎陽虛證免疫功能失衡提供分子生物學(xué)證據(jù)。

1臨床資料

1.1一般資料選擇在陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院男科門診就診且治療顯效的腎陽虛證患者9例，均無器質(zhì)性疾病，年齡35～48(42.67±4.52)歲。中醫(yī)臨床表現(xiàn)以腰膝酸痛、畏寒肢冷、尺脈不足為主癥，兼癥有精神不振、性欲減退、腰背發(fā)冷、夜尿頻多等，參照文獻(xiàn)[5]所載腎陽虛證辨證因子評分細(xì)則，9例患者均具備主證4項，兼證3項以上，定性定量積分>18分，為典型的腎陽虛證。所有受試者均簽署知情同意書，實驗過程獲得陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2試劑和儀器反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，rTaq酶及配套試劑購自TAKARA公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix(DRR041A)購自TAKARA公司；普通PCR儀為ABI 9700型PCR擴(kuò)增儀，定量PCR儀為ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀。

1.3方法

1.3.1治療方法及療效評定患者均給予右歸膠囊(江西銀濤藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z20030134，批號：1504014)口服，每次2粒，每天2次，空腹連服1個月。治療前后分別按照腎陽虛證辨證因子評分細(xì)則對9例患者進(jìn)行評分，治療后證候積分減少≥70%為顯效。積分減少率=(治療前積分-治療后積分)/治療前積分×100%。

1.3.2提取外周血單個核細(xì)胞(PBMC)分別于治療前后采集患者外周血10 mL，EDTA抗凝，無菌條件下Ficoll液常規(guī)方法分離PBMC，每管加入0.5 mL Trizol試劑，充分抽打、混勻，置于-80 ℃以下凍存以備RNA的制備。

1.3.3qPCR法檢測TLR4、MyD88及NF-κBmRNA表達(dá)水平將純化的PBMC,根據(jù)Trizol Regent 的操作步驟,提取總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性與純度,要求能夠清晰呈現(xiàn)28S、18S條帶,OD260/OD280比值介于1.8～2.0之間。取總RNA 20～50 μg，去除RNA基因組，按步驟合成cDNA第一鏈。采用SYBEGREEN qPCR法檢測TLR4、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)水平，內(nèi)參基因為18S rRNA。PCR引物信息見表1。參照說明書設(shè)定PCR程序，95 ℃10 min變性，然后95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，重復(fù)40個循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束，設(shè)定最佳閾值，獲取Ct(threshold cycle)值，根據(jù)儀器給出的標(biāo)準(zhǔn)曲線和斜率，獲得目的基因的相對表達(dá)指數(shù)。

表1　各目的基因的引物序列及產(chǎn)物大小

注：①為內(nèi)參照基因。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以表示。采用相對定量法[6]分析各目的基因mRNA相對表達(dá)水平。以18S rRNA作為內(nèi)參照基因，計算各目的基因在每個樣本的ΔCt(ΔCt = Ct目的基因-Ct18S rRNA)值，采用配對t檢驗方法比較各目的基因mRNA治療前后表達(dá)差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各樣本RNA質(zhì)控圖各樣本提取出的RNA經(jīng)紫外分光光度計測定吸光度，每個樣品OD260/OD280均>1.7，RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示28S和18S條帶清晰，質(zhì)檢結(jié)果合格。電泳圖見圖1。

圖1　治療前后各樣本RNA電泳圖

2.2擴(kuò)增曲線和溶解曲線通過對TLR4、MyD88、NF-κB及管家基因18S rRNA的溶解曲線分析發(fā)現(xiàn)，每條目的基因都有單一的Tm(DNA溶解溫度)值，相應(yīng)地出現(xiàn)一個單一的吸收峰，表明實驗中PCR產(chǎn)物的均一性良好，各基因的擴(kuò)增具有特異性。擴(kuò)增曲線及溶解曲線見圖2～9。

圖2　18S的擴(kuò)增曲線

圖4　TLR4的擴(kuò)增曲線

圖5　TLR4的溶解曲線

圖6　MyD88的擴(kuò)增曲線

圖7　MyD88的溶解曲線

圖8　NF-κB的擴(kuò)增曲線

圖9　NF-κB的溶解曲線

2.3治療前后各通路基因mRNA的表達(dá)差異治療后，患者TLR4mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，MyD88、NF-κBmRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P均<0.05)。見表2。

表2　治療前后各目的基因mRNA相對

注：①與治療前比較，P<0.05。

3討論

腎為先天之本，正氣之根，決定先天稟賦的強(qiáng)弱，關(guān)系到正氣的盛衰，具有調(diào)整和維持機(jī)體免疫平衡的重要作用。腎蘊(yùn)涵腎陰和腎陽，二者協(xié)調(diào)平衡，則處于“陰平陽秘”狀態(tài)，表現(xiàn)為機(jī)體的自我調(diào)節(jié)能力、適應(yīng)環(huán)境能力、抗邪防病能力和康復(fù)自愈能力等的正常。這和強(qiáng)調(diào)人體“防御、自穩(wěn)和監(jiān)視”三大功能的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫理論是一致的。如果腎陽虧虛，陰陽失調(diào)，則機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)失衡。免疫穩(wěn)態(tài)的維持需要一系列免疫分子的信息傳遞和整合，信號通路則是實現(xiàn)這些生物學(xué)過程的重要路徑。TLR/MyD88通路是一條介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。因此，借助經(jīng)典免疫信號通路TLR4介導(dǎo)的MyD88/NF-κB信號通路研究和腎陽虛證方證相應(yīng)的右歸丸的療效機(jī)制具有確切的理論依據(jù)。

選擇典型病例是影響實驗結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。在臨床病例的采集中，本研究采取了腎陽虛證四診癥狀調(diào)查表計分和專家診斷相結(jié)合的方法，首先根據(jù)腎陽虛證辨證因子評分量表在門診對患者進(jìn)行調(diào)查表計分初篩，然后再由中醫(yī)臨床專家診斷確定并跟蹤觀察右歸丸臨床療效。經(jīng)過療效評定篩選了9例達(dá)到顯效的患者作為qPCR實驗檢測對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后患者TLR4mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)，提示右歸丸可以調(diào)控腎陽虛證TLR4/MyD88/NF-κB通路基因的表達(dá)。

生物體內(nèi)的信息傳遞和整合是由細(xì)胞內(nèi)外的受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)來完成的，不同的信號通路之間存在相互的聯(lián)系和作用[7]。TLR/MyD88通路是一條介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，TLRs激活后通過依賴MyD88和非依賴MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,最終引起核因子NF-κB活化、炎性反應(yīng)因子分泌增加[8]。研究證明該通路的異常與腎陽虛證的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。本研究通過對腎陽虛證經(jīng)右歸丸治療前后該通路基因的表達(dá)比較，也證實了此結(jié)論，說明腎陽虛證存在著免疫功能紊亂，且右歸丸可以糾正腎陽虛證免疫紊亂狀態(tài)，而對TLRs信號通路的調(diào)節(jié)作用可能是這種糾正作用的分子機(jī)制之一。本研究從免疫信號通路角度揭示了右歸丸對腎陽虛證的調(diào)控機(jī)制，為右歸丸治療腎陽虛證的宏觀療效提供了理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]沈自尹.補(bǔ)腎法調(diào)節(jié)腎陽虛T細(xì)胞凋亡的規(guī)律—重塑基因平衡[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2004,2(5):321-324

[2]蔡定芳,沈自尹,張玲娟,等. 右歸丸對皮質(zhì)酮大鼠細(xì)胞免疫及細(xì)胞因子的影響[J]. 中國免疫學(xué)雜志,1995,11(4):248-251

[3]Majewska M,Szczepanik M. The role of Toll-like receptors (TLR) in innate and adaptive immune responses and their function in immune response regulation[J]. Postepy Hig Med Dosw(Online),2006,60(60):52-63

[4]譚從娥，王米渠. 右歸丸對腎陽虛證患者干預(yù)效應(yīng)的差異表達(dá)基因功能網(wǎng)絡(luò)分析[J]. 中成藥,2013,35(9):1875-1879

[5]嚴(yán)石林,高鋒,吳斌,等. 腎陽虛證半定量化操作標(biāo)準(zhǔn)的研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,13(6):701-702

[6]Schmittgen TD,Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J]. Nature Protocol,2008,3(6):1101-1108

[7]Estrada E. Complex biomolecular networks:challenges and opportunities[J]. Brief Funct Genomics,2012,11(6):417-419

[8]Hasan U，Chaffois C，Gaillard C，et al. Human TLR10 is a functional receptor，expressed by B cells and plasmacytoid dendritic cells, which activates gene transeription through MyD88[J]. J Immunol，2005，174(5):2942-2950

[9]沈自尹. 以藥測證對腎虛證基因網(wǎng)絡(luò)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(12):1125-1128

Effect of Yougui Pills on TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway of patients with Kidney-Yang deficiency syndrome

TAN Conge，F(xiàn)ENG Wenzhe,CHEN Jinyan,YANG Fei

(Shaanxi University of TCM, Xianyang 712046, Shaanxi, China)

Abstract:Objective It is to discuss the immune regulation mechanism of Yougui Pills on the Kidney-Yang deficiency syndrome. Methods Nine Kidney-Yang deficiency patients were selected for one month treatment with Yougui Pills. Accumulated clinical scores of Kidney-Yang deficiency were assessed pre-treatment and post-treatment using a 40-factor questionnaire. Nine patients were all observed with good therapeutic efficacy and were prepared for Real-time Quantitative PCR (qPCR) tests. 10mL blood were collected to tract Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) for each patients pre-treatment and post-treatment with Yougui Pills. With the RNA from PBMC, we did qPCR tests to detect mRNA expressed value of three target genes of TLR4, MyD88 and NF-κB. Results TLR4, MyD88 and NF-κB genes of Kidney-Yang deficiency patients were significantly expressed after treated by Yougui Pills, the TLR4 gene was down regulated while the MyD88 and NF-κB gene was up regulated. Conclusion Yougui Pills could regulate the expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway, which may be one of the molecular mechanisms for Yougui Pills to regulate the immune function of Kidney-Yang deficiency syndrome.

Key words:Kidney-Yang deficiency syndrome; Yougui Pill; TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway; real-time quantitative PCR

[收稿日期]2015-12-30

[中圖分類號]R-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)14-1483-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.001

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(81473559)；陜西省教育廳自然科學(xué)專項課題(2013JK0821)；咸陽市科技局項目(2012K16-02)

[作者簡介]譚從娥，女，副教授，從事中醫(yī)診斷學(xué)研究。