張 軍，曾凡星，王大鵬(.燕山大學(xué) 體育學(xué)院，河北 秦皇島 066004；.北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 00084)

?運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練對(duì)心肌哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白和下游信號(hào)通路的影響

張 軍1，曾凡星2，王大鵬1
(1.燕山大學(xué) 體育學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2.北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084)

研究顯示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能激活mTOR信號(hào)通路，mTOR信號(hào)通路能影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能。那么，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練對(duì)心肌哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和下游信號(hào)通路有何影響？值得深入研究。研究方法：72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為8組： 3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練組和3周安靜對(duì)照組、3 d、6 d和2周減量訓(xùn)練組及相應(yīng)的安靜對(duì)照組。3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練采用上坡跑、坡度10%、速度20 m/min的中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和26 m/min的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)。然后進(jìn)行減量訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度保持不變，運(yùn)動(dòng)時(shí)間由60 min減少到20 min。持續(xù)進(jìn)行3 d、6 d和2周的減量訓(xùn)練。末次運(yùn)動(dòng)后12 h麻醉取血，取左心室肌。Western blotting測(cè)mTOR、p70S6激酶(p70S6K)的蛋白表達(dá)和磷酸化。心肌組織的形態(tài)學(xué)利用HE染色光鏡觀察。研究結(jié)果：3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練和2周減量訓(xùn)練后，心肌組織的形態(tài)沒有顯著改變，心肌組織沒有損傷。3 d減量訓(xùn)練組與安靜對(duì)照組相比，mTOR(Ser2448)磷酸化有顯著差異(P<0.05)。大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練后，心肌p70S6K(Thr389)磷酸化顯著增加(P<0.05)。減量訓(xùn)練后，心肌p70S6K顯著減少(P<0.05)。S6K磷酸化和激活40S核糖體S6蛋白，有利于蛋白質(zhì)生物合成。結(jié)論：減量訓(xùn)練造成心肌mTOR激活，對(duì)心臟有利。3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練和2周減量訓(xùn)練后，心肌組織的形態(tài)沒有顯著改變，心肌組織沒有損傷。3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練后，心肌p70S6K(Thr389)磷酸化顯著增加，促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯，合成蛋白質(zhì)。然而，減量訓(xùn)練后心肌p70S6K顯著減少。S6K脫磷酸減少蛋白質(zhì)翻譯成分的合成，蛋白質(zhì)合成顯著下降。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；p70S6激酶；減量訓(xùn)練

科學(xué)訓(xùn)練中的減量訓(xùn)練很重要。關(guān)于減量訓(xùn)練對(duì)心臟的影響尚不清楚。研究顯示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能激活mTOR信號(hào)通路，mTOR信號(hào)通路能影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能。筆者探討運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練對(duì)心肌mTOR的下游信號(hào)通路的影響，分析對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響，為科學(xué)訓(xùn)練提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

72只雄性SD大鼠，7周齡，北體大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，溫度保持在(24±1)℃，相對(duì)濕度(50±10)%。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠1周適應(yīng)性訓(xùn)練后，隨機(jī)分為8組：3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練組(E3)和3周安靜對(duì)照組(C3)、3d(E4)、6d(E5)和2周減量訓(xùn)練組(E6)，以及相應(yīng)的安靜對(duì)照組(C4、C5和C6)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物訓(xùn)練方案 運(yùn)動(dòng)分為大運(yùn)動(dòng)量和減量訓(xùn)練。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練采用上坡跑、坡度10%、速度20 m/min的中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和26 m/min的大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，3周內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸增加。然后進(jìn)行減量訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度保持不變，運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸減少。持續(xù)進(jìn)行3 d、6 d和2周的減量訓(xùn)練。

1.2.3 主要試劑和方法 用Western blotting方法測(cè)定mTOR、p70S6激酶(p70S6K)蛋白和磷酸化。Western blotting過(guò)程包括樣品準(zhǔn)備、制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、化學(xué)發(fā)光和結(jié)果計(jì)算等?？贵w購(gòu)自Cell Signaling公司。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水平用P<0.05表示。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組與各自的安靜對(duì)照組相比，P<0.05表明具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌組織形態(tài)的影響

HE染色可見各組心肌細(xì)胞著色為紅色，排列規(guī)則，染色均勻，輪廓清晰，縱切面心肌呈長(zhǎng)圓柱狀。3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練和2周減量訓(xùn)練后，心肌組織的形態(tài)沒有顯著改變，心肌組織沒有損傷的形態(tài)學(xué)改變(圖1)。

注：A 3周安靜對(duì)照組；B 3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練組；C 2周減量對(duì)照組；D 2周減量訓(xùn)練組。圖1 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果(×200)

2.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練對(duì)心肌mTOR(Ser2448)磷酸化的影響

3 d減量訓(xùn)練組與安靜對(duì)照組相比，心肌mTOR(Ser2448)的磷酸化有顯著差異(P<0.05)。大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練組與安靜對(duì)照組相比，心肌mTOR(Ser2448)磷酸化無(wú)顯著變化(P>0.05)(表1、圖2)。

表1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練后心肌mTOR(Ser2448)磷酸化的變化

注：#表示與3 d對(duì)照組相比，有顯著性差異，P<0.05。

2.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練對(duì)心肌p70S6K的影響

與各自的對(duì)照組相比，3 d、6 d和2周減量訓(xùn)練后，心肌p70S6K均顯著減少(P<0.05) (表2、圖3)。

表2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練后心肌p70S6K的變化

注：#△□分別表示與安靜對(duì)照組相比，有顯著性差異，P<0.05。

圖2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練后心肌mTOR(Ser2448)磷酸化的變化

圖3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練后心肌p70S6K的變化

2.4 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練對(duì)心肌p70S6K(Thr389)磷酸化的影響

與3周安靜對(duì)照組相比，3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練后，心肌p70S6K(Thr389)磷酸化顯著增加(P<0.05) (表3、圖4)。

表3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練后心肌p70S6K(Thr389)磷酸化的變化

注：*表示與安靜對(duì)照組比較，有顯著性差異，P<0.05。

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練對(duì)心肌mTOR的影響

研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練激活心肌mTOR信號(hào)通路[1]。研究發(fā)現(xiàn)間歇性的有氧運(yùn)動(dòng)激活大鼠心臟mTOR和下游的信號(hào)蛋白[2]。本實(shí)驗(yàn)的前期研究發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)后mTOR(Ser2448)磷酸化，運(yùn)動(dòng)后6 h達(dá)到峰值。大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)后mTOR(Ser2448)磷酸化，運(yùn)動(dòng)后6 h達(dá)到峰值[3]。本研究發(fā)現(xiàn)3周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后減量訓(xùn)練3 d，心肌mTOR(Ser2448)的磷酸化也顯著增加，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練造成心肌mTOR的激活，對(duì)心臟有利。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR通過(guò)營(yíng)養(yǎng)素、胰島素、細(xì)胞能量和應(yīng)激等細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)[4]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練和2周減量訓(xùn)練后，心肌組織的形態(tài)沒有顯著改變，心肌組織沒有損傷。

圖4 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練后心肌p70S6K(Thr389)磷酸化的變化

3.2 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練對(duì)心肌p70S6K的影響

本實(shí)驗(yàn)的前期研究發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度與大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，大鼠心肌p70S6K蛋白含量不變；中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后12 h磷酸化的p70S6K (Thr389)達(dá)到峰值，運(yùn)動(dòng)后24 h仍未恢復(fù)；而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后24 h，磷酸化的p70S6K (Thr389)顯著降低[5]。研究發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后1 h、6 h和12 h，大鼠骨骼肌S6K(Thr389)磷酸化水平顯著提高，24 h后恢復(fù)到安靜水平。運(yùn)動(dòng)后S6K(Thr389)磷酸化與mTOR(Ser2448)磷酸化基本同步[3]。Mascher研究受試者在功率自行車上完成有氧耐力運(yùn)動(dòng)，結(jié)果骨骼肌mTOR(Ser2448)磷酸化，S6K(Ser424/Thr421)磷酸化[6]。Haddad等觀察急性運(yùn)動(dòng)后，與對(duì)側(cè)肌肉相比，p70S6K磷酸化增加2.5倍，然后迅速下降，說(shuō)明一次運(yùn)動(dòng)后p70S6K激活的持續(xù)時(shí)間有限，而有規(guī)律地多次運(yùn)動(dòng)引起p70S6K持續(xù)激活。在第二次運(yùn)動(dòng)后，p70S6K磷酸化增加得到加強(qiáng)，第二次運(yùn)動(dòng)后40 h仍有顯著增加[7]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練后，心肌p70S6K(Thr389)磷酸化顯著增加，促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯，合成蛋白質(zhì)。然而，減量訓(xùn)練后，心肌p70S6K顯著減少。而在減量訓(xùn)練過(guò)程中，心肌p70S6K逐漸升高，而p70S6K(Thr389)磷酸化和p70S6K(Thr389)磷酸化/p70S6K逐漸降低。

S6K是mTOR下游的重要效應(yīng)物。PI3K/Akt途徑介導(dǎo)增殖的上游信號(hào)后，mTOR磷酸化并激活S6K。隨后，S6K磷酸化和激活40S核糖體S6蛋白，促進(jìn)40S核糖體亞基募集到有翻譯活性的多核糖體，有5’TOP序列的mRNAs翻譯增加。這些有5’TOP序列的mRNAs編碼核糖體蛋白、延伸因子，如eEF1α和eEF2、poly A結(jié)合蛋白和胰島素樣生長(zhǎng)因子II，是蛋白質(zhì)生物合成的基礎(chǔ)。S6K脫磷酸減少蛋白質(zhì)翻譯成分的合成，蛋白質(zhì)合成顯著下降[8-10]。S6K通過(guò)提高mRNA翻譯控制細(xì)胞生長(zhǎng)，5’TOP mRNA翻譯需要S6K[11]。rpS6是S6K的下游因子，一般認(rèn)為rpS6磷酸化是S6K激活的結(jié)果。S6K能增加與eIF4B和eEF2激酶的接觸。eEF2激酶通過(guò)磷酸化翻譯延長(zhǎng)因子eEF2使其受到抑制。S6K能使eEF2激酶磷酸化，抑制其活性，從而提高eEF2的活性[12]。S6K使eIF4B磷酸化，促進(jìn)其募集到起始復(fù)合物。mTOR通過(guò)調(diào)節(jié)S6K產(chǎn)生有效的翻譯起始或延長(zhǎng)過(guò)程[13]。

4 結(jié)論

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和減量訓(xùn)練能引起心肌mTOR激活，是對(duì)心臟有利的因素。3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練和2周減量訓(xùn)練后，心肌組織的形態(tài)沒有顯著改變，心肌組織沒有損傷。3周大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練后，心肌p70S6K(Thr389)磷酸化顯著增加，促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯，合成蛋白質(zhì)。然而，減量訓(xùn)練后，心肌p70S6K顯著減少。S6K脫磷酸減少蛋白質(zhì)翻譯成分的合成，蛋白質(zhì)合成顯著下降。

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責(zé)任編輯：郭長(zhǎng)壽

Effects of Training and Tapering on Myocardium mTOR and Backward Position of mTOR Signal Pathway

ZHANG Jun1，ZENG Fanxing2，WANG Dapeng1
(1.Physical Education College，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei，China；2.Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing 100084，China)

Researches reveal that training activates mTOR signal pathway.mTOR signal pathway affects the formation and function of the heart.How do the training and tapering influence mTOR and backward position of signal pathway? It deserves further research.Methods：the 72 SD rats are divided into 8 groups randomly；3 weeks rest control group，3 weeks intensive training group，3 days rest control group，3 days tapering training group，6 days rest control group，6 days tapering training group，2 weeks rest control group，and 2 weeks tapering training group.We adopted moderate intensity(20 m/min，grade of 10%)and high intensity(26 m/min，grade of 10%) by turn in 3 weeks intensive training.Training time prolonged gradually from 60 min to 120min.After 3 weeks of intensive training，the process of tapering training followed.This process also adopted moderate intensity(20 m/min，grade of 10%)and high intensity(26 m/min，grade of 10%) by turn.But the training time decreased gradually.Tapering training included 3 kinds：3 days，6 days and 2 weeks tapering training.The left ventricle cardiac muscle has been got，and been tested for mTOR and p70S6K protein expression and protein phosphorylation by Western blotting.The conformation of cardiac muscle organization was observed by HE coloration in the light mirror.Results：The conformation of cardiac muscle organizations weren’t changed significantly after 3 weeks of great volume of training and 2 weeks of tapering.There were not any injuries in the cardiac muscles.MTORSer2448 phosphorylation increased significantly after tapering 3 days.P70S6K (Thr389) phosphorylation increased significantly after 3 weeks intensive training (P<0.05).P70S6K decreased significantly in cardiac muscle after tapering (P<0.05).S6K1 dephosphorylation decreases the synthesis of components of the protein translation system and results in a profound decrease in protein synthesis.Conclusions：Tapering can induce the activation of myocardium mTOR and is good for the heart.The conformation of cardiac muscle organizations wasn’t changed significantly after 3 weeks of great volume of training and 2 weeks of tapering.P70S6K (Thr389) phosphorylation increased significantly after 3 weeks intensive training which resulted in some protein translation increase，and in favor of protein synthesis.P70S6K decreased significantly in cardiac muscle after tapering which resulted in some protein translation decreased，and some protein synthesis decreased.

mTOR；p70S6K；tapering

2016-02-27；

2016-03-21

燕山大學(xué)博士基金項(xiàng)目(B920)；燕山大學(xué)青年教師自主研究計(jì)劃課題(15SKB009)。

張 軍(1981—)，男，講師，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與心血管結(jié)構(gòu)和功能。

G804.7

A

1004-0560(2016)02-0082-04