劉　華,楊貴義，欽傳輝

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院,湖北 隨州 441300)

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槐耳清膏對(duì)手術(shù)切除結(jié)腸癌后腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制研究

劉華,楊貴義，欽傳輝

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院,湖北 隨州 441300)

[摘要]目的探討槐耳清膏對(duì)手術(shù)切除結(jié)腸癌后腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制。方法將實(shí)施結(jié)腸癌根治性手術(shù)的患者64例按照隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，對(duì)照組僅進(jìn)行常規(guī)治療，治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上同時(shí)服用槐耳清膏。觀察患者腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況，通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)人巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ?HME)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，并通過(guò)Western blot測(cè)定缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF-1α)的表達(dá)。結(jié)果治療組的復(fù)發(fā)率和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)。2組中發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的HME表達(dá)均較弱，VEGF表達(dá)均較強(qiáng)，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；而未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者中治療組HME表達(dá)顯著強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)，VEGF表達(dá)顯著弱于對(duì)照組(P<0.05)。2組已發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的HIF-1α蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者中治療組HIF-1α表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。治療組復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者HME、VEGF及HIF-1α蛋白表達(dá)與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論槐耳清膏對(duì)結(jié)腸癌切除術(shù)后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有顯著改善作用，且可以增強(qiáng)患者HME表達(dá)，抑制VEGF的表達(dá)，同時(shí)降低HIF-1α表達(dá)。其作用機(jī)制可能與其抗血管生成作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]槐耳清膏；結(jié)腸癌；人巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ福谎軆?nèi)皮生長(zhǎng)因子；缺氧誘導(dǎo)因子；復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，手術(shù)根治性切除是其主要治療方法，但效果并不理想。手術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌手術(shù)失敗和患者生存率低的主要原因[1-2]?；倍甯郲3]是藥用真菌槐耳發(fā)酵后的熱水提取物，含有多種有機(jī)成分和礦物質(zhì)元素，蛋白多糖是其發(fā)揮抗癌作用的活性成分。已有研究表明，槐耳清膏能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抗腫瘤血管生成，對(duì)化療藥物有增敏和逆轉(zhuǎn)耐藥作用，能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等[4]，但對(duì)抑制結(jié)腸癌腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取2011年3月—2013年3月來(lái)我院實(shí)施結(jié)腸癌根治性手術(shù)的64例患者，分析槐耳清膏對(duì)手術(shù)切除結(jié)腸癌后腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的影響及相關(guān)機(jī)制，旨在為臨床治療結(jié)腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1臨床資料

1.1一般資料選取上述時(shí)期來(lái)我院實(shí)施結(jié)腸癌根治性手術(shù)的患者64例，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌，為首次手術(shù)；經(jīng)2位醫(yī)生評(píng)估生存時(shí)間>3年；患者自愿參加本研究，簽署知情同意書(shū)。排除處于妊娠期、老年或兒童期；有其他重大并發(fā)癥者。術(shù)前診斷時(shí)均未發(fā)現(xiàn)臨床遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移證據(jù)，術(shù)中亦未發(fā)現(xiàn)肝臟及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的證據(jù)，手術(shù)前均未行放、化療治療，術(shù)后有明確的組織病理學(xué)診斷。按照隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為2組：治療組32例，男24例，女8例；年齡(56±5)歲；腫瘤大小≤3 cm 14例，>3 cm 18例；按照Duke’s分期標(biāo)準(zhǔn)，A期 11例，B期9例，C期12例。對(duì)照組32例，男18例，女14例；年齡(55±4)歲；腫瘤大小≤3 cm 15例，>3 cm 17例；Duke’s分期：A期11例，B期11例，C期10例。2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2方法2組均給予結(jié)腸癌術(shù)后規(guī)范治療。在此基礎(chǔ)上，治療組服用槐耳清膏(醫(yī)院自制)，6～9 g/d，分3次服用，連續(xù)服用3～6個(gè)月；對(duì)照組不服用槐耳清膏。要求結(jié)腸癌患者術(shù)后1年內(nèi)每隔3個(gè)月復(fù)查1次；2～5年內(nèi)每隔6個(gè)月復(fù)查1次。至少完成3年隨訪。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病例經(jīng)病理、CT、B超、X射線檢查4項(xiàng)中至少1項(xiàng)證實(shí)，病理切片通過(guò)再次手術(shù)或腸鏡檢查獲得；未復(fù)發(fā)病例結(jié)腸切片通過(guò)腸鏡檢查獲得。

1.3人巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ?HME)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及缺氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF-1α)表達(dá)檢測(cè)所有獲得的病理組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、乙醇梯度脫水、石蠟包埋，切片厚度4 μm。載玻片經(jīng)多聚賴氨酸溶液預(yù)處理以防止脫片。采用過(guò)氧化物標(biāo)記的鏈霉卵白素染色法(S-P法)，操作嚴(yán)格按照試劑盒(購(gòu)自福州邁新公司)說(shuō)明進(jìn)行，使用羊抗人HME多克隆抗體和鼠抗人VEGF多克隆抗體(均購(gòu)自Santa Cruz公司)按上述方法進(jìn)行HME和VEGF的免疫組織化學(xué)染色。HME及VEGF主要定位于胞漿內(nèi)，陽(yáng)性者可見(jiàn)胞漿內(nèi)的棕黃色顆粒，觀察組織的陽(yáng)性細(xì)胞率及著色強(qiáng)度。采用Western blot法測(cè)定2組腫瘤組織中HIF-1α蛋白表達(dá)情況。

2結(jié)果

2.12組術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況在3年隨訪過(guò)程中經(jīng)B超、CT或結(jié)腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組有18例出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為56%；治療組有6例出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為18%。治療組復(fù)發(fā)率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組有15例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有4例出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為59%；治療組有6例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，2例出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為25%。治療組腫瘤轉(zhuǎn)移率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2HME、VEGF、HIF-1α在患者結(jié)腸癌組織內(nèi)的表達(dá)HME陽(yáng)性表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞胞漿的中的棕黃色顆粒、間質(zhì)中炎性細(xì)胞、部分成纖維細(xì)胞中；VEGF表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞胞漿或胞膜，非癌組織中也可見(jiàn)表達(dá)。本研究中2組已發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的HME表達(dá)差異比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者中治療組HME表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，且治療組內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者HME表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組已發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的VEGF的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者中治療組VEGF表達(dá)較對(duì)照組降低(P<0.05)，且治療組內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者VEGF表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot 檢測(cè)顯示2組已發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者中治療組HIF-1α的蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，且治療組內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　2組術(shù)后組織內(nèi)HME、VEGF水平及HIF-1α

注：①與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移比較，P<0.05;②與對(duì)照組比較，P<0.05。

3討論

近年來(lái)，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年增高，占胃腸道腫瘤的第3位。其好發(fā)部位為直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處，發(fā)病多在40歲以后，男女之比為(2～3)∶1。結(jié)腸癌的臨床表現(xiàn)隨其病灶大小所在部位及病理類型而有所不同。不少早期結(jié)腸癌患者在臨床上可毫無(wú)癥狀，但隨著病程的發(fā)展和病灶的不斷增大，可以產(chǎn)生一系列結(jié)腸癌的常見(jiàn)癥狀，諸如大便次數(shù)增多、大便帶血和黏液、腹痛、腹瀉或便秘、腸梗阻以及全身乏力、體重減輕和貧血等癥狀[5]。該病具有起病隱匿、早發(fā)現(xiàn)率低和預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重危及患者生命安全[6]。目前隨著診療技術(shù)的發(fā)展和人們健康意識(shí)的增加，早期結(jié)腸癌的診斷率和治療率明顯上升。手術(shù)仍是公認(rèn)的治療結(jié)腸癌的方法之一。但是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌切除術(shù)失敗和患者死亡的主要原因，且有結(jié)腸癌家族史的患者為結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的高危人群[7]。這些問(wèn)題仍是困擾醫(yī)生和相關(guān)研究人員的焦點(diǎn)問(wèn)題，因此研究結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要的臨床意義，能夠?yàn)椴捎每茖W(xué)合理的治療方案提供參考依據(jù)，以便最大限度地改善患者的預(yù)后。

中藥能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，使術(shù)后患者的免疫系統(tǒng)功能得到恢復(fù)、增強(qiáng)，與化療有協(xié)同增效與減毒作用，特別對(duì)化療引起的消化道反應(yīng)、造血機(jī)能抑制等有保護(hù)作用，故不僅在國(guó)內(nèi)，在世界上一些發(fā)達(dá)國(guó)家也日益受到重視。對(duì)結(jié)腸癌術(shù)后患者，中醫(yī)一般采用益氣健脾、清熱解毒治法，根據(jù)辨證結(jié)果，還可結(jié)合通絡(luò)散結(jié)法，具體用藥因人而異，根據(jù)不同病期、不同體質(zhì)、不同證型等情況，進(jìn)行個(gè)體化治療[8]。

槐耳是我國(guó)民間中藥的藥用真菌，其味苦辛、性平無(wú)毒，有“治風(fēng)”“破血”“益力”之功效[9]?；瘜W(xué)分析其槐耳提取物槐耳清膏中槐耳多糖蛋白(PS-T)是主要活性成分，多糖蛋白為蛋白結(jié)合雜多糖，具有抗癌活性。其抗癌機(jī)制主要為促進(jìn)巨噬細(xì)胞功能、誘導(dǎo)細(xì)胞因子、促進(jìn)細(xì)胞免疫功能、提高體液免疫力、抑制腫瘤血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株等[10]。目前，臨床上已廣泛用于治療肝癌、乳腺癌及消化道惡性腫瘤。本文研究顯示，加用槐耳清膏治療后，結(jié)腸癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率降低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移速率降低，說(shuō)明槐耳清膏具有一定地抑制結(jié)腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的作用。

由于結(jié)腸癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多步驟、多因素的發(fā)展過(guò)程，因此需要研究相關(guān)的生物活性產(chǎn)物在體內(nèi)的表達(dá)[11]。HME是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMP)中的一員[12-13]。MMP已被證實(shí)可通過(guò)抑制腫瘤微血管生成來(lái)減少腫瘤體積和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，HME又稱為基質(zhì)金屬蛋白酶12(MMP-12)，可使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為血管穩(wěn)定因子，是一種重要的腫瘤血管形成的抑制因子。HME在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，可發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子也稱血管通透性因子(VPF)或促血管素，最初是由多種培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的一種新型的生長(zhǎng)因子，它能增加微血管與小靜脈血管的通透性[14-15]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，該因子特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，所以定名為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。是目前所知的在腫瘤生長(zhǎng)中作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生成調(diào)控因子，在許多腫瘤新生血管的形成中起著關(guān)鍵作用，與結(jié)腸癌發(fā)展過(guò)程中新生血管的形成和轉(zhuǎn)移也有密切關(guān)系[16]。

本研究中，通過(guò)免疫組織化學(xué)法觀察2組術(shù)后復(fù)發(fā)患者和未復(fù)發(fā)患者間HME和VEGF表達(dá)的差異，結(jié)果顯示未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者中，治療組HME表達(dá)高于對(duì)照組，VEGF表達(dá)低于對(duì)照組，治療組內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者HME、VEGF表達(dá)有顯著性差異。提示槐耳清膏可以通過(guò)抗腫瘤血管生成作用，增強(qiáng)抑制患者HME，降低VEGF的表達(dá)，從而減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α可通過(guò)調(diào)控多種靶基因表達(dá)以逃避或適應(yīng)相對(duì)低氧環(huán)境，參與腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[17]。本研究治療組經(jīng)槐耳清膏治療后，顯示未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者中HIF-1α表達(dá)降低，組內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者HIF-1α蛋白表達(dá)有顯著性差異。說(shuō)明槐耳清膏抑制結(jié)腸癌腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制與HME和VEGF的表達(dá)有關(guān)，通過(guò)抑制HIF-1α的生成，下調(diào)相關(guān)因子的表達(dá)，從而抑制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步提示槐耳清膏有抗血管生成的作用。

綜上所述，槐耳清膏能夠抑制結(jié)腸癌腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，抑制HIF-1α的表達(dá)，從而增強(qiáng)HME表達(dá)，下調(diào)VEGF的表達(dá)，起到了很好的抗腫瘤作用，為臨床進(jìn)一步應(yīng)用槐耳清膏治療結(jié)腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，值得臨床推廣應(yīng)用。但本研究所用樣本量有限，需進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證槐耳清膏的療效。

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[收稿日期]2015-06-23

[中圖分類號(hào)]R735.35

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)09-0968-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.09.020