龐學(xué)豐++劉莎莎++李玉玲++劉歡++蒙宇華++姚平++馮玉青++吳燕紅++唐麗萍

【摘 要】目的：觀察清熱解毒抗風(fēng)濕方藥——熱痹康湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠滑膜血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的影響。方法：將60只清潔級雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對照組，模型對照組，甲氨蝶呤組，熱痹康湯低、中、高劑量組，每組10只。除空白對照組外，其余各組大鼠采用弗氏不完全佐劑聯(lián)合牛Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)CIA大鼠模型。造模成功后開始給藥，模型對照組給予生理鹽水灌胃，熱痹康湯低、中、高劑量組分別給予熱痹康湯提取物低、中、高劑量灌胃，甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤灌胃，空白對照組大鼠自由飲水和進(jìn)食。觀察不同劑量熱痹康湯對CIA大鼠的關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)及其滑膜VEGF的影響。結(jié)果：熱痹康湯各劑量組及甲氨蝶呤組大鼠的關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均低于模型對照組（P < 0.01），其中中劑量熱痹康湯作用與甲氨蝶呤相當(dāng)（P > 0.05），高劑量熱痹康湯作用優(yōu)于甲氨蝶呤（P < 0.01）；熱痹康湯各劑量組及甲氨蝶呤組大鼠滑膜的VEGF水平均低于模型對照組（P < 0.05），其中高劑量熱痹康湯作用優(yōu)于甲氨蝶呤（P < 0.05），中、低劑量熱痹康湯作用與甲氨蝶呤相當(dāng)（P > 0.05）。結(jié)論：熱痹康湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制是通過抑制滑膜VEGF的產(chǎn)生而實現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；熱痹康湯；血管內(nèi)皮生長因子；大鼠

Effect of Rebikang Tang（熱痹康湯）on Vascular Endothelial Growth Factor in Rats with Collagen-induced Arthritis

PANG Xue-feng，LIU Sha-sha，LI Yu-ling，LIU Huan，MENG Yu-hua，YAO Ping，F(xiàn)ENG Yu-qing，WU Yan-hong，TANG Li-ping，LEI Zong-shang，SHU Jian-long，WANG Si-chao，DU Yong-yi，LIN Ju

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rebikang Tang（熱痹康湯—a prescription of clearing away heat and toxic materials and anti-rheumatism）on vascular endothelial growth factor（VEGF）in rats with collagen-induced arthritis（CIA）.Methods：Sixty clean-grade female Wistar rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，a methotrexate group，and low，medium and high-dose Rebikang Tang groups，10 rats in each group.Except the blank control group，the rats in the other groups were induced by the incomplete adjuvant combined with collagen typeⅡto establish CIA rat models.The model control group was given intragastric administration of physiological saline，the low，medium and high-dose Rebikang Tang groups were given corresponding dose of Rebikang Tang，the methotrexate group was given intragastric administration of methotrexate and the rats in the control group could drink water and eat food freely.The effects of different doses of Rebikang on joint swelling index and VEGF were observed.Results：The joint swelling indexes in each dose of Rebikang group and the methotrexate group were lower than that of the model group（P < 0.01），among which the effect in the medium-dose Rebikang group was equivalent to that of the methotrexate group（P > 0.05） and the effect in the high-dose Rebikang group was superior to that of the methotrexate group（P < 0.01）.The synovial VEGF levels in each Rebikang group and the methotrexate group were lower than that of the model control group

（P < 0.05），among which the effect of the high-dose Rebikang group is superior to the methotrexate（P < 0.05），

while the effects of the middle and low-dose Rebikang groups were equivalent to the methotrexate（P > 0.05）.Conclusion：The mechanism of Rebikang Tang in the treatment of rheumatoid arthritis can be achieved by inhibiting the generation of VEGF.

【Keywords】 collagen-induced arthritis；arthritis，rheumatoid；Rebikang Tang（熱痹康湯）；vascular endothelial

growth factor；rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種主要侵犯外周關(guān)節(jié)的慢性自身免疫性疾病。不經(jīng)規(guī)范治療的晚期RA患者會出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在RA的發(fā)病、發(fā)展中起到重要的作用。本研究通過給予CIA大鼠灌服清熱解毒抗風(fēng)濕方藥——熱痹康湯，探討其對CIA大鼠滑膜VEGF的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級雌性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量（110±10）g，購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。動物合格證號：桂醫(yī)動字第11005號。飼養(yǎng)在空氣流通、溫度約22～25 ℃、濕度適中（不低于40%）的安靜動物房內(nèi)。

1.2 實驗試劑 牛Ⅱ型膠原蛋白、弗氏不完全佐劑（美國Chondrex公司）；檢測VEGF所需試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 實驗藥物 本院新藥研發(fā)中心負(fù)責(zé)制備提供本實驗研究所用的熱痹康湯提取物，將熱痹康湯（原藥）提取制成含有活性部位的浸膏（由本院新藥研發(fā)中心負(fù)責(zé)制作）。造模時按比例加入乙醇和生理鹽水溶解配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2×10-7 g·L-1的溶液供大鼠造模。甲氨蝶呤片購自上海醫(yī)藥（集團(tuán)）有限公司信誼制藥總廠。

2 方 法

2.1 分組與造模 將60只清潔級Wistar雌性大鼠放置于鼠籠中進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，觀察7 d無異常后隨機(jī)分為模型對照組，甲氨蝶呤組，熱痹康湯低、中、高劑量組，每組10只。除空白對照組外，其余各組大鼠按步驟分別進(jìn)行造模（方法參照文獻(xiàn)[2]）：實驗時于無菌條件下，在冰面上將牛Ⅱ型膠原蛋白充分溶解于冰醋酸中，接著加入相同體積的弗氏不完全佐劑，隨后一起注入醫(yī)用三通管內(nèi)，用注射器互相推吸以充分混合乳化，制成油包水狀的CⅡ乳劑，完成后把它放置于4 ℃的冰箱進(jìn)行保存。進(jìn)行造模時，分別將CⅡ乳劑分多點注射于Wistar大鼠的背部和尾部皮內(nèi)。注射后觀察大鼠14 d，無異常后再次注射CⅡ乳劑（所用方法和藥物劑量同前所述）進(jìn)行免疫。

2.2 給藥治療 按70 kg人體質(zhì)量與200 g大鼠換算系數(shù)為0.018，甲氨蝶呤組大鼠按甲氨蝶呤藥液

2.7 mg·kg-1進(jìn)行灌胃，每周1次；熱痹康湯高劑量組大鼠給予31.25 g·（100 g）-1·d-1的熱痹康湯提取物進(jìn)行灌胃，中劑量組大鼠給予15 g·（100 g）-1·d-1

的熱痹康湯提取物進(jìn)行灌胃，低劑量組大鼠給予

7.5 g·（100 g）-1·d-1的熱痹康湯提取物進(jìn)行灌胃，每日分2次灌服；模型對照組大鼠給予生理鹽水

2 mL·（100 g）-1灌服，每日1次?？瞻讓φ战M大鼠不限制飲水，自由進(jìn)食。

2.3 關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)評分 治療前及治療后第1，2，4周分別做好各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)的觀察并詳細(xì)記錄。評分4分及以上即為造模成功（評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行擬定：其中表現(xiàn)為包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部關(guān)節(jié)腫脹者評為4分，選取造模成功的大鼠進(jìn)行下一階段實驗）。

2.4 滑膜VEGF的檢測 除空白對照組外，其余各組大鼠均按計劃給藥。4周后所有大鼠均采用水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉完全后于無菌條件下在膝關(guān)節(jié)處快速剝離滑膜組織，放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)錅y。采用免疫組化法測定滑膜中的VEGF含量，項目檢測步驟及方法嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，2組間療效比較采用t檢驗，各組間的療效比較采用方差分析。以

P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠治療前后關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)比較 與模型對照組比較，各治療組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)治療

2周后均有降低，其中熱痹康湯高、中劑量組及甲氨蝶呤組與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

（P < 0.01）。各治療組大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)治療

4周后與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

（P < 0.01），其中熱痹康湯中劑量組作用與甲氨蝶呤組相當(dāng)（P > 0.05），熱痹康湯高劑量組作用優(yōu)于甲氨蝶呤組（P < 0.01）。見表1。

3.2 各組大鼠治療前后滑膜VEGF變化比較

各組大鼠滑膜VEGF水平明顯高于空白對照組（P < 0.01）；各給藥組大鼠治療4周后的滑膜VEGF水平與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。熱痹康湯中、低劑量組與甲氨蝶呤組療效相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；

熱痹康湯高劑量組與甲氨蝶呤組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠治療前后滑膜VEGF變化比較

組別 動物數(shù)（只） VEGF（%）

空白對照組 10 4.52±0.46

模型對照組 10 29.75±3.131）

甲氨蝶呤組 10 23.25±1.751）2）

熱痹康湯低劑量組 10 22.62±1.821）2）

熱痹康湯中劑量組 10 21.84±1.711）2）

熱痹康湯高劑量組 10 17.61±1.671）2）3）

注 與空白對照組比較，1）P < 0.01；與模型對照組比較，2）P < 0.05；與甲氨蝶呤組比較，3）P < 0.05

4 討 論

RA的發(fā)病和病情進(jìn)展過程中，血管翳的形成會導(dǎo)致關(guān)節(jié)的破壞、畸形以及功能障礙，而血管翳形成的重要環(huán)節(jié)之一就是血管新生。VEGF在RA的發(fā)病、發(fā)展中起到非常重要的作用。有一項研究將RA患者與健康人群及退行性骨關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RA患者血清中VEGF水平明顯升高，并且發(fā)現(xiàn)其與炎性指標(biāo)、類風(fēng)濕因子以及病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，筆者認(rèn)為可以把VEGF作為判斷RA病情是否活動的一個指標(biāo)[4-5]。有實驗研究證實，經(jīng)向RA關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射VEGF抗體或其受體拮抗劑進(jìn)行治療，可以減輕RA的癥狀以及明顯抑制滑膜血管翳的形成[6]。近年來多方面的研究結(jié)果已經(jīng)表明，通過抑制VEGF的表達(dá)這一途徑治療RA的研究已逐漸成為新的熱點和方向之一。

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹病”范疇，多為機(jī)體虛弱，御邪能力低下，風(fēng)寒濕熱之邪入侵，痹阻于內(nèi)，氣血運行不暢，筋脈瘀阻而成。熱痹康湯是課題負(fù)責(zé)人根據(jù)上述理論認(rèn)識，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗總結(jié)出的經(jīng)驗方，由秦艽、防風(fēng)、桂枝、威靈仙、制川烏、地龍、桑枝、葛根、忍冬藤、青風(fēng)藤、黃柏、蒼術(shù)組成，具有清熱解毒、利濕除痹止痛功效，治療RA效果較好，能明顯改善濕熱型患者的晨僵、關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)壓痛、關(guān)節(jié)腫脹及關(guān)節(jié)功能，降低患者血液中明顯升高的C-反應(yīng)蛋白、類風(fēng)濕因子、紅細(xì)胞沉降率以及免疫球蛋白等實驗室指標(biāo)，毒副作用較少，患者耐受程度較好[7]。已完成的動物實驗研究表明，熱痹康湯能降低膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中升高的白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α及基質(zhì)金屬蛋白酶-3的水平[8-12]，提示熱痹康湯能通過影響這些在RA的發(fā)病過程中起重要作用的促炎因子而達(dá)到治療的作用。

本實驗結(jié)果表明，熱痹康湯可以通過抑制VEGF的產(chǎn)生，抑制血管翳的形成以及滑膜增殖，減輕炎癥而起到治療RA的作用，為進(jìn)一步研究熱痹康湯的作用機(jī)制提供了實驗依據(jù)。

（下轉(zhuǎn)第24頁）

（上接第14頁）

5 參考文獻(xiàn)

[1] 陳灝珠.實用內(nèi)科學(xué)[M].北京.人民衛(wèi)生出版社，2009：2708-2716.

[2] 鄧安梅，仲人前，陳孫孝，等.關(guān)節(jié)炎中B7：CD28/CTLA-4共刺激途徑的實驗研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2000，16（8）：412-414.

[3] Shibuya M.Differential roles of vascular endothelial growth factor receptor-1 and receptor-2 in angiogenesis[J].

J Biochem Mol Biol，2006，39（5）：469-478.

[4] Clavel G，Bessis N，Lemeiter D，et al.Angiogenes is markers（VEGF，soluble receptor of VEGF and ang iopoietin-1）in very early arthritis and their association with inflammation and joint destruction[J].Clinical Immunol，2007，124（2）：158-164.

[5] 樊有龍，傅穎媛.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者AECA、VEGF、

IL-17的檢測及臨床相關(guān)性研究[J].中國實驗診斷學(xué)，2010，14（6）：907-910.

[6] Grosios K，Wood J，Esser R，et al.Angiogenesis inhibition by the novel VEGF receptor tyrosine kinase inhibitor，PTK787/ZK222584，causes significant anti-arthritic effects in models of rheumatoid arthritis[J].Inflamm Res，2004，53（4）：133-142.

[7] 龐學(xué)豐，蒙宇華.熱痹康膠囊治療濕熱型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎86例療效觀察[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，20（2）：106-108.

[8] 龐學(xué)豐，龍朝陽，劉歡，等.熱痹康湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清TNF-α及IL-6的影響[J].廣西中醫(yī)藥，2012，35（2）：51-52.

[9] 劉歡，龐學(xué)豐，吳燕紅，等.熱痹康湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β及IL-4的影響[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，2（1）：55-57.

[10] 龐學(xué)豐，蒙宇華，劉歡，等.熱痹康湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜P38/NF-κB信號通路的影響[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5（10）：5-7，11.

[11] 劉歡，龐學(xué)豐.熱痹康湯對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-2及IL-10的影響[J].廣西中醫(yī)藥，2010，33（1）：48-50.

[12] 龐學(xué)豐，李玉玲，劉歡，等.熱痹康湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶-3的影響[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2013，2（4）：32-34.

收稿日期：2016-09-13；修回日期：2016-10-25