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        無乳鏈球菌VicRK雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的功能預測

        2016-05-30 10:48:04郭桂英徐圣杰徐港侯國峰蒲文淵楊諾曾紀峰鄭繼平
        熱帶農(nóng)業(yè)工程 2016年1期
        關鍵詞:生物信息學

        郭桂英 徐圣杰 徐港 侯國峰 蒲文淵 楊諾 曾紀峰 鄭繼平

        摘 要 VicRK可調(diào)控細胞壁代謝,是部分低G+C值革蘭氏陽性菌中最為關鍵的雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。為預測該系統(tǒng)在無乳鏈球菌中的具體功能,依據(jù)VicR蛋白與調(diào)控基因啟動子結合的17 bp保守基序,采用perl語言編寫生物信息學軟件,對中國魚源無乳鏈球菌GD201008-001全基因組進行雙向探查。結果顯示,在該基因組中,oppA、deoR、acpP、NPD、cas9和pcsB等11個基因啟動子中存在VicR結合位點,通過結合各基因的生物學功能進行預測可知,VicRK雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在無乳鏈球菌中可能具有調(diào)節(jié)滲透壓、脂肪酸代謝和細胞壁代謝等功能,同時具有參與細菌免疫和細菌毒力等重要作用。

        關鍵詞 無乳鏈球菌 ;雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng) ;VicRK ;保守基序 ;生物信息學

        中圖分類號 S182

        Abstract VicRK is a conserved and important two component system in low G+C gram-positive bacteria,which controls the cell wall metabolism. To predict the specific functions of VicRK in Streptococcus agalactiae(SA),a computer program was written by using the perl computer language. All the sited of the conserved 17 bp VicR binding motif in the SA strain GD201008-001were dig out by whole-genome screening,and 11 sites were found in different promoters. Combining the function of the downstream genes which were oppA, deoR, acpP, NPD, cas9 and pcsB etc,it was speculated that VicRK would take a role in control of osmotic pressure,metabolism of fatty acid and cell wall,regulation of immunity and virulence in Streptococcus agalactiae.

        Key words Streptococcus agalactiae ;two component system ;VicRK ;conserved motif ; bioinformatics

        雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)(two-component signal transduction system,TCS)是細菌積極應對外界多變環(huán)境、維持自身有效存活的信號傳遞系統(tǒng),該系統(tǒng)由跨膜的組氨酸蛋白激酶(histidine kinase,HK)和胞內(nèi)的反應調(diào)控蛋白(response regulator,RR)組成,HK和RR通過磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)細胞的信號傳遞,并通過RR與特異啟動子的結合,調(diào)控對應靶基因的表達,實現(xiàn)細胞對外界環(huán)境變化的實時應答。VicRK是廣泛存在于低G+C值革蘭氏陽性菌中的高度保守的雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng),該系統(tǒng)調(diào)控細胞壁的代謝平衡,對細胞存活具有決定性作用,是防治致病菌的理想靶標[1],其中VicR為胞內(nèi)RR,VicK為跨膜HK。已有研究表明,A群鏈球菌的VicRK非條件突變菌株具有明顯的弱毒活性[2],已作為弱毒疫苗正在研發(fā)。

        無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae,SA)或稱 B群鏈球菌(Group B Streptococcus,GBS),可引起人類以及多種陸生和水生生物產(chǎn)生腦膜炎、肺炎和敗血癥等多種疾病,具有較高的致病和致死率。由于沒有有效的防治手段,近年來,水產(chǎn)無乳鏈球菌病害頻繁爆發(fā),并以羅非魚無鏈球菌病害最為嚴重[3],直接影響到中國作為羅非魚第一生產(chǎn)大國的地位。因此,急需加強該菌的防治措施?;赩icRK在細胞壁代謝中的關鍵作用及其在疫苗開發(fā)中的重要價值,筆者對其在無乳鏈球菌中的功能進行了探究。

        目前,VicRK在無乳鏈球菌的具體作用與功能尚無相關報道,為此,本研究依據(jù)枯草芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌中VicRK結合位點的保守基序,設計生物信息學軟件,對無乳鏈球菌的全基因組進行雙向篩查,獲取并分析該菌中VicRK的調(diào)控基因,進而預測此雙組分轉(zhuǎn)導系統(tǒng)在無乳鏈球菌的調(diào)控功能,為進一步利用該系統(tǒng)開發(fā)弱毒疫苗提供科學依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        Genbank序列數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov);perl語言程序(http://www.perl.org/)

        1.2 方法

        1.2.1 保守基序全基因組雙向查詢軟件設計

        從Perl官網(wǎng)(http://www.perl.org/)下載相應版本。首先下載和安裝Windows(x86)Active State Perl程序,繼而從notepad官網(wǎng)下載和安裝與本地電腦相配的版本;在windows32操作系統(tǒng)下,依據(jù)基因組DNA雙鏈結構特點,編寫具有雙向查詢特定序列功能的formatedb.pl和promoter_search.pl語言程序。

        1.2.2 搜索數(shù)據(jù)庫的構建

        從NCBI Genome database上檢索無乳鏈球菌基因組序列,下載魚源無乳鏈球菌GD201008-001菌株全長基因組的genebank(full)格式與fastag格式,并將其命名為對應的sequence.fasta和sequence.gb 2個文件,將其放置于上步編寫程序的同一文件夾中;雙擊formatedb.pl程序自動讀取sequence.fasta和sequence.gb 2文件,最后在bin文件下自動生成相關的3個數(shù)據(jù)庫(fcis_element.sum、forward.sum和genebank2.db)。

        1.2.3 VicRK全基因組結合位點查尋

        雙擊打開promoter_search.pl程序,輸入修改后的VicRK結合位點保守基序TGTWAH-N5-WGTWAH(W:A\T,R:A\G,H:A\T\C,N:A\T\C\G),按下ENTER鍵運行程序,然后按Ctrl+D,接著按ENTER鍵開始搜索;搜索結束后,自動生成一個key_sequence文件夾,其中有4個子文件,分別為:0fasta_p.fa、0id_gene_p.fa、0sum_Promoter.xls和0ther_result_p.out。其中0fasta_p.fa是查詢的保守基序fasta的格式列表;0id_gene_p.fa是保守基序所對應的下游基因列表信息,包括基因ID在基因組中的位置,保守基序與下游基因的距離等;0sum_Promoter.xls是保守基序所對應的下游基因全部信息列表;other_result_p.out是除上述文件列出之外的其他相關信息列表。

        1.2.4 VicRK功能預測

        分析key_sequence輸出信息,篩查出存在于啟動子上的保守基序,獲取這些啟動子所對應的基因功能,進而預測VicRK在無乳鏈球菌中可能的調(diào)控作用。

        2 結果與分析

        2.1 保守基序搜索軟件的編寫

        采用Perl語言所編寫的KSS(Key sequence search)軟件大小為6 MB,包含的文件有0fasta_p.fa、0id_gene_p.fa、0sum_Promoter.xls、0ther_result_p.out、formatedb.pl、promoter_search.pl、sequence.fasta、sequence.gb和一個bin文件,其中bin中含有keysequence.pl、sequence.pl、forward.pl、reverse.pl、annotation.pl、fcis_element_sum、forward.sum、genbank.db等8個子文件。KSS核心代碼如下。

        #!/usr/bin/perl

        open OUT1, ">key-sequence.txt";

        print'my $R =(A,G);

        my $Y=(C,T);

        my $M=(A,C);

        my $W=(A,T);

        my $K=(G,T);

        my $S=(C,G);

        my $B=(C,G,T);

        my $V=(A,C,G);

        my $D=(A,G,T);

        my $H=(A,C,T);

        my $N=(A,T,G,C)';

        print"\nplease,entry your sequence,and press ENTER to end.\n";

        my $sequence=;

        chop($sequence);

        print"the resoult are:\n";

        my $sequencef=$sequence;

        $revcom=reverse $sequence;

        # See the text for a discussion of tr///

        $sequencef=~tr/ACGTRYMKSWHDBVacgtrymkswhdbvn/ACGTRYMKSWHDBVACGTRYMKSWHDBVN/;

        $revcom=~tr/ACGTRYMKSWHDBVacgtrymkswhdbvn/TGCAYRKMWSDHVBTGCAYRKMWSDHVBN/;

        print"$sequencef\n";

        print"$revcom\n";

        print OUT"$sequencef\n";

        print OUT"$revcom\n";

        my $sequencef_save=$sequencef;

        $_=$sequencef_save;

        s/A/[$A]/gi;

        s/T/[$T]/gi;

        s/G/[$G]/gi;

        s/C/[$C]/gi;

        s/R/[$R]/gi;

        s/M/[$M]/gi;

        s/K/[$K]/gi;

        s/S/[$S]/gi;

        s/W/[$W]/gi;

        s/H/[$H]/gi;

        s/D/[$D]/gi;

        s/B/[$B]/gi;

        s/V/[$V]/gi;

        s/Y/[$Y]/gi;

        s/N/[$N]/gi;

        $sequencef_save=$_ ;

        print"the forword key-sequence are:\n" .$sequencef_save."\n";

        print OUT1"the forword key-sequence are:\n".$sequencef_save ."\n";

        my $revcom_save=$revcom;

        $_=$revcom_save;

        s/A/[\$A]/gi;

        s/T/[\$T]/gi;

        s/G/[\$G]/gi;

        s/C/[\$C]/gi;

        s/R/[\$R]/gi;

        s/M/[\$M]/gi;

        s/K/[\$K]/gi;

        s/S/[\$S]/gi;

        s/W/[\$W]/gi;

        s/H/[\$H]/gi;

        s/D/[\$D]/gi;

        s/B/[\$B]/gi;

        s/V/[\$V]/gi;

        s/Y/[\$Y]/gi;

        s/N/[\$N]/gi;

        $revcom_save=$_;

        print"the revers key-sequence are:\n" .$revcom_save ."\n";

        print OUT1"the reverse key-sequence are:\n".$revcom_save ."\n";

        open OUT2,">dealed-with-file.txt";

        my $sequence;

        open SEQUENCE ,"while(

        VicRK高度保守,在枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌中,其結合位點序列也存在一定的保守性,最為保守的部分為TGTWAH-N5-TGTWAH(W:A\T,R:A\G,H:A\T\C,N:A\T\C\G)[4-5];但在變異鏈球菌中,VicRK的保守基序有少許變化,為TGTWAHA-N4-TGTWAHA[6]。在本研究中,為能夠更有效地預測VicRK在無乳鏈球菌中可能的結合位點,筆者對VicRK的調(diào)控基因PcsB基因[7]的上游序列進行了先行分析,結果發(fā)現(xiàn),在無乳鏈球菌和變異鏈球菌中,該基因的上游64 bp處,除一個堿基外,都存在一個近乎完全符合TGTWAH-N5-TGTWAH的保守序列。因此,筆者采用微調(diào)的TGTWAH-N5-YGTWAH序列,通過KSS設計軟件,對VicRK在無乳鏈球菌基因組中可能存在的結合位點進行預測。

        通過預測發(fā)現(xiàn),在無乳鏈球菌GD201008-001中,VicRK可能存在11個結合位點,對應的基因包括細胞壁代謝基因、毒力基因、自身免疫基因、物質(zhì)轉(zhuǎn)運基因、脂肪酸合成基因、營養(yǎng)代謝基因和蛋白翻譯基因等,由此預測,VicRK通過調(diào)控這些基因的表達來參與相關生物學活性的調(diào)節(jié)。但是在無乳鏈球菌中,VicRK是否真的具有以上的結合位點,仍需要通過進一步的實質(zhì)性驗證才能證實。

        參考文獻

        [1] Dubrac S,Bisicchia P,Devine K M,et al. A matter of life and death:cell wall homeostasis and the WalKR(YycGF)essential signal transduction pathway[J]. Mol Microbiol,2008,70(6):1 307-1 322.

        [2] Liu M,Hanks T S,Zhang J,et al. Defects in ex vivo and in vivo growth and sensitivity to osmotic stress of group A Streptococcus caused by interruption of response regulator gene vicR[J]. Microbiology,2006,152(4):967-978.

        [3] 郭玉娟,張德鋒,樊海平,等. 中國南方地區(qū)羅非魚無乳鏈球菌的分子流行病學研究[J]. 水產(chǎn)學報,2012,36(3):399-406.

        [4] Dubrac S,Msadek T. Identification of genes controlled by the essential YycG/YycF two-component system of Staphylococcus aureus[J]. J Bacteriol, 2004,186(4):1 175-1 181.

        [5] Echenique J R,Trombe M C. Competence repression under oxygen limitation through the two-component MicAB signal transducing system in Streptococcus pneumoniae and involvement of the PAS domain of MicB[J]. J Bacteriol,2001,183(15):4 599-4 608.

        [6] Ayala E,Downey J S,Mashburn-Warren L,et al. A biochemical characterization of the DNA binding activity of the response regulator VicR from Streptococcus mutans[J]. PLoS One,2014,9(9):e108 027.

        [7] Ng W L,Robertson G T,Kazmierczak K M,et al. Constitutive expression of PcsB suppresses the requirement for the essential VicR(YycF)response regulator in Streptococcus pneumoniae R6[J]. Mol Microbiol,2003,50(5):1 647-1 663.

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