盛　敏，　謝　定*，　文　李，　焦　玲，　姜　博，　方　芳，　劉雄赳（.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙404；.長(zhǎng)沙帥牌油脂有限責(zé)任公司，湖南長(zhǎng)沙40008）

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畢赤酵母展示海藻糖合成酶及其性質(zhì)研究

盛敏1，謝定*1，文李1，焦玲1，姜博1，方芳1，劉雄赳2
（1.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410114；2.長(zhǎng)沙帥牌油脂有限責(zé)任公司，湖南長(zhǎng)沙410008）

摘要：利用畢赤酵母表面展示天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）海藻糖合成酶（Trehalose synthesase，TS，EC 5.4.99.16）并研究其酶學(xué)性質(zhì)。人工合成酵母內(nèi)源壁蛋白（GPI-modified wall proteins，GCW14）與天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶組合DNA（GCW14-TS），將其亞克隆到pPIC9k載體后轉(zhuǎn)化到GS115酵母菌中，成功構(gòu)建了pPIC9k -GCW14-TS載體，并將TS展示在畢赤酵母GS115表面，然后對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)其在30～45℃溫度范圍都能發(fā)揮作用，最適pH為8.5，K+、Mg2+等金屬離子對(duì)其有促進(jìn)作用且重復(fù)使用5次后仍然可以保持75%以上的酶活性。該基因工程菌具有海藻糖合成酶固定化酶性質(zhì)，可用于將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：海藻糖合成酶；畢赤酵母；全細(xì)胞催化劑酶學(xué)性質(zhì)

海藻糖（Trehalose）是兩分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷鍵相連而成的非還原性二糖，由于其具有對(duì)生物體優(yōu)良的抗逆保護(hù)作用等優(yōu)良性能而被譽(yù)為“生命之糖”和“二十一世紀(jì)的新型糖類”，在食品、保健、醫(yī)療等行業(yè)的應(yīng)用越來越普遍，因而其大規(guī)模制造方法受到廣泛關(guān)注[1]。在海藻糖酶法生產(chǎn)工藝中，利用海藻糖合成酶將麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖的方法具有簡(jiǎn)單、快速、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)[2]，因此，近些年越來越多的海藻糖合成酶基因被分離、提純并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)[3-5]。但海藻糖合酶在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后需要破壁取酶，重組蛋白也易以包涵體的形式存在，因而存在酶量不夠且難以重復(fù)利用等不足。近些年，酵母菌展示技術(shù)的應(yīng)用研究越來越廣。利用酵母菌展示酶作催化劑（也稱全細(xì)胞催化劑whole cell catalyst）可以提高酶的產(chǎn)量，使用過程中無需分離純化，且可重復(fù)利用，因而可以解決上述大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該酶的不足。目前應(yīng)用較多的為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與畢赤酵母（Pichaia pastoris），這兩種表面展示系統(tǒng)是一種新型的真核表達(dá)系統(tǒng)，兼具原核生物易于培養(yǎng)繁殖快和真核生物蛋白翻譯后的修飾功能兩大系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，可以高效表達(dá)外源蛋白而細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌極少，可以進(jìn)行高密度發(fā)酵，可用于表達(dá)具有生物活性的外源蛋白[6-8]。相較于釀酒酵母，畢赤酵母表達(dá)外源蛋白糖基化程度較低，也具有乙醇氧化酶基因誘導(dǎo)型的強(qiáng)啟動(dòng)子。目前，已有畢赤酵母成功展示多種酶的報(bào)道，但尚未見畢赤酵母表面成功展示海藻糖合成酶的報(bào)道。本研究以畢赤酵母GS115作為細(xì)胞載體構(gòu)建酵母表面展示系統(tǒng)展示海藻糖合成酶并初步研究了該全細(xì)胞催化劑的酶學(xué)性質(zhì)。

1　材料和方法

1.1 GCW14-TS組合DNA

根據(jù)林影等[9]畢赤酵母內(nèi)源壁蛋白（GPI-modified wall proteins，GCW14）序列以及韋宇拓等[10]的天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）海藻糖合成酶（Trehalose synthesase，TS，EC 5.4.99.16）序列，設(shè)計(jì)了酵母內(nèi)源壁蛋白（GCW14）與天藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合成酶組合DNA（GCW14-TS）序列，GCW14-TS序列的5’端添加了Eco RI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端添加了Not I位點(diǎn)。Eco RI-GCW14-TS-Not I由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到pUC57載體的多克隆位點(diǎn)上，命名為pUC57-GCW14-TS。（6-360bp為GCW14，361-2058bp為TS）

GAATTC5’-6gcttactctaacgtaacttacacttacgagactac catcaccgatgttgtcaccgagctcaccacttactgcccagagccaaccacct tcgttcacaagaacaagaccatcactgtgaccgccccaaccactttgaccatc actgactgtccttgcaccatctccaagaccaccaagatcaccactgatgttcc accaaccacccactccaccccacacaccaccaccactcacgtgccatctac ctctaccccagctccaacccactctgtttctaccatctctcacggtggtgctgct aaggctggtgttgctggtttggccggtgttgctgctgccgctgcttacttcttg 360ATGATCGTCAACGAGCCCGTGCCGGACACCTT CGAGGACACCCCCGCCAAGGACCGGGACCCGGAC TGGTTCAAACGAGCCGTCTTCTACGAGGTCCTCGT CCGCTCCTTCCAGGACAGCAACGGCGACGGCATC GGTGATCTCAAGGGCCTGACCGCCAAGCTGGACT ACCTGCAATGGCTCGGCGTGGACTGCCTGTGGCT CCCGCCCTTCTTCAAGTCACCGCTGCGCGACGGCG GTTACGACGTCTCCGACTACACCGCCGTGCTGCCG GAGTTCGGCGACCTGGCCGACTTCGTGGAGTTCGT GGACGCGGCGCACCAGCGCGGCATGCGCGTGATC ATCGACTTCGTCATGAACCACACCAGCGACCAGC ACCCGTGGTTCCAGGAGTCCCGCAGGAACCCGGA CGGCCCCTACGGCGACTACTACGTCTGGGCCGAC GACGACAAGCAGTTCCAGGACGCGCGGATCATCT TCGTCGACACCGAGGCGTCCAACTGGACCTACGA CCCGGTGCGCAAGCAGTACTACTGGCACCGGTTC TTCTCCCACCAGCCGGACCTCAACTACGAGAACCC GGTCGTGCAGGAGGAGATGATCTCCGCGCTGAAG TTCTGGCTGGACCTGGGCATCGACGGGTTCCGGCT GGACGCGGTGCCGTACCTCTACCAGGAGGAGGGC ACCAACTGCGAGAACCTCCCGCGCACGCACGACT TCCTGAAGCGGGTGCGCAAGGAGATCGACGCGCA GTACCCGGACACGGTGGTGCTGGCCGAGGCCAAC CAGTGGCCGGAGGACGTGGTCGACTACTTCGGCG ACTACGCGGCGGGCGGCGACGAGTGCCACATGGC CTTCCACTTCCCCGTCATGCCCCGCATCTTCATGGC GGTCAGAAGGGAGTCCCGCTACCCGGTCTCCGAA ATCCTCGCCAAGACCCCGGCCATCCCGTCCGGCTG CCAGTGGGGCATCTTCCTGCGCAACCACGACGAG CTGACCCTGGAGATGGTCACCGACGAGGAACGCG ACTACATGTACGCGGAGTACGCCAAGGACCCGCGCATGCGCGCCAACATCGGCATCCGGCGCAGGCTC GCCCCGCTCCTCGACAACGACCGCAACCAGATCG AGCTGTTCACCGCCCTGCTGCTGTCCCTGCCCGGC TCGCCGATCCTCTACTACGGCGACGAGATCGGCAT GGGCGACAACATCTGGCTCGGCGACCGCGACGCC GTGCGCACCCCCATGCAGTGGACGCCCGACCGCA ACGCGGGCTTCTCGTCGTCCGACCCGGGCCGCCTG TTCCTGCCCACGATCATGGACCCGGTCCACGGTTA CCAGGTGACGAACGTCGAGGCGTCCATGGCCTCG CCCTCCTCCCTGCTGCACTGGACCCGGCGCATGAT CGAGATCCGCAAGCAGAACGTGGCCTTCGGCCTG GGCACCTACACCGAGCTGCCGTCGTCCAACCCTG CCGTCCTGGCCTTCCTGCGCGAACACGAGGACGA CCTGGTGCTGTGCGTCCACAACTTCTCCCGGTTCG CGCAGCCGACGGAGCTGGACCTCAGCGCCTTCGA CGGACGCCATCCGGTCGAGCTGTTCGGCGGGGTC CGCTTCCCGGCGGTCGGTGACCTGCCGTACCTGCT GACCCTGGGCGGTCACGGCTTCTACTGGTTCCGCC TGCGCAAGGACGCCGCC2058-3’GCGGCCGC（2066bp）

1.2主要儀器設(shè)備

瓊脂糖凝膠電泳儀：DYCP-31DN型，北京天池儀誠(chéng)生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀：DOC2000型，美國(guó)Bio-Red公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床：NS-2102C型，天津市歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品；紫外-可見分光光度計(jì)：UV2600型，上海舜宇恒平有限公司產(chǎn)品。

1.3其它材料和試劑

菌株和質(zhì)粒：pPIC9K：購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115宿主菌：購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；工具酶、試劑與試劑盒：限制性內(nèi)切酶EcoR I、Not I、Mlu I、Sac I，T4 DNA連接酶，DNA Marker：購(gòu)自大連寶生物科技有限公司（takara）；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒：購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品；PEG3350、LiCl：購(gòu)于美國(guó)sigma公司；其他試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4方法

1.4.1 pPIC9K-GCW14-TS載體的構(gòu)建分別將pUC57-GCW14-TS和pPIC9K載體進(jìn)行Eco RI和Not I雙酶切反應(yīng)，37℃水浴4 h后用1.2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。采用凝膠回收試劑盒對(duì)目的基因片斷GCW14-TS和pPIC9K載體片段進(jìn)行回收。再用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接反應(yīng)，22℃過夜連接，將其轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布在含有amp和kana抗性的LB固體培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)后挑取克隆進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行Eco RI和Not I雙酶切反應(yīng)，并用1.2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將陽(yáng)性克隆命名為pPIC9KGCW14-TS。

1.4.2 pPIC9K-GCW14-TS轉(zhuǎn)化到畢氏酵母GS115中按照如下步驟進(jìn)行：煮沸1 mL鮭魚精DNA 5 min，迅速冰浴后以制備單鏈擔(dān)體DNA；將pPIC9KGCW14-TS用Sac I內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理；將感受態(tài)酵母菌GS115離心，用Tips去除殘余的LiCl溶液；對(duì)于每一個(gè)轉(zhuǎn)化，按以下順序加入：PEG3350，240 mL；1 mol/L LiCl，36 mL；2 mg/mL單鏈Salmon sperm DNA，25 mL；0.1～0.2 mg/mL質(zhì)粒DNA，50 mL；劇烈旋渦混勻至沉淀菌體完全分布均勻（約1 min）；30℃水浴孵育30 min；42℃水浴熱休克20～25 min；6 000～8 000 r/min離心收集酵母菌體；重懸酵母于1 mL YPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育；1～4 h后，取25～100 mL菌液鋪YD選擇性培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)2～3 d鑒定（將表達(dá)菌株和對(duì)照菌株在固體培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)）。

1.4.3全細(xì)胞催化劑粗酶液的制備將畢赤酵母重組菌接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的BMGY培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min培養(yǎng)4～5 d，每24 h添加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。收集發(fā)酵菌體，菌泥用pH 8.0緩沖液洗滌3次。經(jīng)離心后得濕菌體，將離心后的濕菌體進(jìn)行稱重，并與本研究前期所采用的重組大腸桿菌同期培養(yǎng)后稱重進(jìn)行比較。取1 g濕菌體懸浮于5 mL Tris-Hcl緩沖液中，制得全細(xì)胞催化劑粗酶液。

1.4.4全細(xì)胞催化劑活力測(cè)定反應(yīng)條件：將上述實(shí)驗(yàn)獲得的粗酶液按體積比1∶1加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的麥芽糖溶液，在35℃、180 r/min反應(yīng)20 h，沸水浴10 min滅酶。調(diào)節(jié)pH后，加入1 mL糖化酶，60℃保溫14 h，沸水浴10 min滅酶。測(cè)定酶活力。酶活力測(cè)定（3，5-二硝基水楊酸法，DNS法）[11]：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于15 mL刻度試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，準(zhǔn)確加入DNS試劑2 mL，沸水煮沸2 min。冷卻至室溫后用水補(bǔ)足至15 mL，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品液經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂專∠♂尯蟮臉悠芬?.0 mL于15 mL刻度試管中，加入DNS試劑2.0 mL，沸水煮沸2 min，冷卻至室溫后用水補(bǔ)足到15 mL，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出稀釋樣品液中的葡萄糖質(zhì)量濃度，再計(jì)算出原樣品液的葡萄糖質(zhì)量濃度。計(jì)算出酶活力。

酶活力定義：在上述條件下，每1 g濕菌體酶1 min催化轉(zhuǎn)化麥芽糖產(chǎn)生1 μg海藻糖為1酶活力單位A（u）。

式中：Δx為葡萄糖差值微克數(shù)（空白-酶反應(yīng)），μg；t為時(shí)間，min。

1.4.5全細(xì)胞催化劑的性質(zhì)研究

1）發(fā)酵時(shí)間對(duì)全細(xì)胞催化劑的活性影響將種子液轉(zhuǎn)移至BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)后加甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵，分別在12，24，36，48，60，72，84 h后取樣，離心制得全細(xì)胞粗酶液，將粗酶液按體積比1∶1加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的麥芽糖溶液，在35℃、180 r/min反應(yīng)14 h，沸水浴10 min滅酶。調(diào)節(jié)pH后，加入1 mL糖化酶，60℃保溫1 h，沸水浴10 min滅酶。測(cè)定酶活力。

2）溫度對(duì)全細(xì)胞催化劑活性的影響將菌體重懸于pH8.0的Tris-Hcl緩沖液制得粗酶液，分別在30，35，40，45，50，55，60，65，70℃下保溫30 min后，將粗酶液按體積比1∶1加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的麥芽糖溶液，在35℃、180 r/min反應(yīng)14 h，沸水浴10 min滅酶。調(diào)節(jié)pH后，加入1 mL糖化酶，60℃保溫1 h，沸水浴10 min滅酶。測(cè)定酶活力。為測(cè)定其溫度的穩(wěn)定性，將全細(xì)胞催化劑粗酶液置于30，40，45，50℃的水浴鍋中分別保溫0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h后再按上述方法測(cè)定其酶活力。

3）pH值對(duì)全細(xì)胞催化劑活性的影響將菌體分別重懸于pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0的緩沖液后，30℃保溫30 min。再以pH 8.0的Tris-Hcl緩沖液洗滌并重懸菌體制得粗酶液將粗酶液按體積比1∶1加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的麥芽糖溶液，在上述反應(yīng)確定的最適溫度下180 r/min反應(yīng)14 h，沸水浴10 min滅酶。調(diào)節(jié)pH后，加入1 mL糖化酶，60℃保溫1 h，沸水浴10 min滅酶。測(cè)定酶活力。為測(cè)定其pH值的穩(wěn)定性，將全細(xì)胞催化劑重懸于pH為pH6 .0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0的緩沖液中，30℃保溫24 h后，再以pH 8.0的Tris-Hcl緩沖液洗滌并重懸菌體制得粗酶液，再按上述方法測(cè)定其酶活力。

4）金屬離子對(duì)全細(xì)胞催化劑活性的影響用去離子水分別配置濃度為0.01 mol/L的Na+、K+、Mg2+、Zn3+、Mn2+、Ca2+、Cu2+、Fe3+等各種金屬鹽溶液，然后將這些金屬鹽溶液與同體積的酶反應(yīng)體系在上述反應(yīng)確定的最適溫度下180 r/min反應(yīng)14 h，沸水浴10 min滅酶。調(diào)節(jié)pH后，加入1 mL糖化酶，60℃保溫1 h，沸水浴10 min滅酶。測(cè)定酶活力。

5）全細(xì)胞催化劑固定化效果將使用過的全細(xì)胞催化劑用緩沖液洗滌3次后并重懸制得粗酶液，重復(fù)1.4.4的步驟測(cè)定全細(xì)胞催化劑的活力。

2　結(jié)果與分析

2.1 pPIC9K-GCW14-TS載體構(gòu)建

分別將pUC57-GCW14-TS和pPIC9K載體進(jìn)行Eco RI和Not I雙酶切反應(yīng)，37℃水浴4 h之后用1.2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳鑒定。采用膠回收試劑盒回收目的基因片斷GCW14-TS和pPIC9K載體片段（圖1）。之后用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接反應(yīng)，22℃過夜連接，之后轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有amp和kana抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行37℃過夜培養(yǎng)。挑取克隆進(jìn)行搖菌，質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行Eco RI和Not I雙酶切反應(yīng)，之后用1.2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將陽(yáng)性克隆命名為pPIC9KGCW14-TS。

圖1　瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis

Displaying of Trehalose Synthase Through Pichia pastoris and its Enzymatic Properties

SHENG Min1，XIE Ding*1，WEN Li1，JIAO Ling1，JIANG Bo1，F(xiàn)ANG Fang1，LIU Xiongjiu2
（1. College of Chemical and Biology，Changsha University of Science and Technology，Changsha 410114，China；2. Changsha Handsome Brand Oil Limited Company，Changsha 410008，China）

Abstract：The study aimed to display trehalose synthase（TS.EC 5.4.99.16）on the surface of Pichiia pastoris and investigate its enzymatic properties. Synthesized gene from Streptomyces coelicolor trehalose synthase and yeast cell wall protein GCW14 was cloned to pPIC9k carrier and transformed into yeast GS115 and thus the pPIC9k-GCW14-TS carrier was constructed to display TS. Then the properties of the recombinant trehalose synthase were determined. Results showed that the recombinant trehalose synthase possessed the optimal temperature 30～45℃and pH 8.5，K+and Mg2+increased its enzymatic capacity and more than 75% of the activity was still remained after it was reused for 5 times. Therefore，this recombinant strain can be repeatedly use as a whole cell catalyst to convert maltose into trehalose.

Keywords：trehalose synthase，Pichaia pastoris，whole cell catalyst enzymatic properties

*通信作者：謝定（1962—），男，湖南耒陽(yáng)人，工學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：cslg5148495@126.com

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015JJ2010）；湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新資助項(xiàng)目；長(zhǎng)沙市重點(diǎn)科技項(xiàng)目（K1205230-11）。

收稿日期：2014-11-02

中圖分類號(hào)：TS 261

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）01—0059—07