唐群芳，　李江華，　劉　龍*，　堵國成，　陳　堅(jiān)（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

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耐有機(jī)溶劑α-葡萄糖苷酶的補(bǔ)料分批發(fā)酵研究

唐群芳1，2，李江華1，2，劉龍*1，2，堵國成1，2，陳堅(jiān)1，2
（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

摘要：作者研究了Bacillus licheniformis JXC-1在3 L發(fā)酵罐上產(chǎn)耐有機(jī)溶劑α-葡萄糖苷酶的關(guān)鍵因素，結(jié)果表明：pH恒定7.0，初始糖質(zhì)量濃度25 g/L，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min為最適產(chǎn)酶條件，酶活由104.6 U/L提高到了444.7 U/L。通過4種補(bǔ)料策略對其進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵研究，得出：4～5 h內(nèi)補(bǔ)料速度為2.25 mL/h，5～6 h內(nèi)補(bǔ)料速度為6.75 mL/h，6～7 h內(nèi)補(bǔ)料速度為9 mL/h，7～8 h內(nèi)補(bǔ)料速度為15 mL/h補(bǔ)加麥芽糖與蛋白胨效果最好，酶活達(dá)到872.5 U/L。

關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌JXC-1；α-葡萄糖苷酶；補(bǔ)料分批發(fā)酵；耐有機(jī)溶劑酶

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidaseE.C.3.2.1.20），又名葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，簡稱α-糖苷酶?？蓮摩?葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖等低聚糖類底物[1]的非還原性末端斷開α-（1，4）糖苷鍵，并能將游離出來的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)葡萄糖分子或麥芽糖或麥芽三糖等分子中的α-（1，6）位上[2-3]，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖（isomaltooligosaccharides，以下簡稱IMO，主要包括異麥芽糖、異麥芽三糖和潘糖等）、糖脂或糖肽等[4-7]。該酶既具有水解能力又具有轉(zhuǎn)移能力，故對其命名說法不一。

α-葡萄糖苷酶在人類的糖原降解及動(dòng)物植物和微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能，它作為工業(yè)化生產(chǎn)IMO的關(guān)鍵酶制劑受到國內(nèi)外食品工業(yè)界的重視[8-9]。而在有機(jī)介質(zhì)中的酶催化反應(yīng)中[10-11]，利用耐有機(jī)溶劑α-葡萄糖苷酶催化反應(yīng)不僅可以增加非極性底物的溶解性，更可通過控制反應(yīng)平衡移動(dòng)的方向極大地提高產(chǎn)率，通過溶劑體系調(diào)節(jié)有效成分使定向的轉(zhuǎn)化或修飾成為可能[12-14]。

針對篩選到的耐有機(jī)溶劑野生菌株Bacillus licheniformis JXC-1生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶產(chǎn)量不高的狀況，作者首先在3 L發(fā)酵罐上優(yōu)化了控制產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素（pH，初糖濃度和攪拌轉(zhuǎn)速）在此基礎(chǔ)上，通過對碳源和有機(jī)氮源的補(bǔ)料流加方式的優(yōu)化，以期進(jìn)一步提高Bacillus licheniformis JXC-1生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的發(fā)酵水平。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株：Bacillus licheniformis JXC-1，生物系統(tǒng)與生物加工工程實(shí)驗(yàn)室選育并保藏，中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號是CCTCC NO：M 2011320；儀器：3 L全自動(dòng)發(fā)酵罐；超聲波細(xì)胞破碎儀；KYC100B培養(yǎng)搖床；其余試劑均為分析純。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1平板培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/ L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

1.2.2種子液培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

1.2.3分批發(fā)酵培養(yǎng)基麥芽糖30 g/L，胰蛋白胨39 g/L，酵母粉3 g/L，CaCl20.4 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.164 g/L，NaCl 0.076 g/L，pH自然。

1.2.4補(bǔ)料生長培養(yǎng)基碳源流加：麥芽糖500 g/ L；碳氮源混合流加：麥芽糖500 g/L，胰蛋白胨780 g/L。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1搖瓶培養(yǎng)將-80℃保存的菌株采用平板劃線法活化后，挑取單菌落，接于裝有30 mL液體LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。

1.3.2發(fā)酵罐培養(yǎng)將液體LB培養(yǎng)基中菌液按體積分?jǐn)?shù)3%接種量接入3 L全自動(dòng)發(fā)酵罐（LiFlus GM BioTRON，Korea）中。裝液量1.5 L，以體積分?jǐn)?shù)25%氨水和鹽酸溶液控制pH值（恒定6.0，7.0，8.0和不控制），溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速（500，600，700，800 r/min），發(fā)酵到一定時(shí)間按要求方式補(bǔ)加一定量的碳源和有機(jī)氮源。發(fā)酵過程由發(fā)酵罐控制系統(tǒng)軟件進(jìn)行在線控制和數(shù)據(jù)采集。

1.4分析測定

1.4.1菌體干重的測定取10 mL發(fā)酵液置于離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，將離心菌體置于105℃，烘至恒重，稱量并計(jì)算菌體干重（g/L）。

1.4.2α-葡萄糖苷酶活性的測定參見文獻(xiàn)[15]。酶活力單位定義：在pH 6.8，37℃的條件下，每分鐘催化水解產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.4.3殘?zhí)菨舛鹊臏y定參見文獻(xiàn)[16]。采用DNS法測量還原糖。取稀釋后的糖液1.0 mL于15 mL刻度試管中，加DNS試劑2.0 mL，沸水煮沸15 min，冷卻后用水補(bǔ)足到15 mL刻度，在540 nm波長下測定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出葡萄糖mg/mL數(shù)，求出樣品中糖含量。

1.4.4比速率的測定

α-葡萄糖苷酶生產(chǎn)強(qiáng)度=（胞內(nèi)酶活/發(fā)酵時(shí)間）

單位菌體胞內(nèi)產(chǎn)酶量=（胞內(nèi)酶活/菌體干重）

2　結(jié)果與討論

2.1 pH控制策略對α-葡萄糖苷酶分批發(fā)酵過程的影響

在前期搖瓶發(fā)酵優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的初始pH是控制產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素。在3 L發(fā)酵罐中，考察不同pH控制策略下菌體生長及產(chǎn)酶的情況，結(jié)果如圖1所示。pH不控制時(shí)，2～10 h為對數(shù)期，大量產(chǎn)酶，最高酶活為104.6 U/L，DCW在10 h時(shí)達(dá)到最高19.6 g/L。而pH控制恒定6.0及8.0時(shí)，細(xì)胞都能良好生長，酶活和DCW均有所上升，而pH控制為恒定7.0對發(fā)酵最為有利，此時(shí)，最高酶活達(dá)到332.6 U/L（12 h），最大DCW達(dá)到33.2 g/L。因此，選擇pH控制策略為恒定7.0。

圖1　pH對α-葡萄糖苷酶分批發(fā)酵過程的影響Fig. 1 Influence of pH on the production of α-glucosidase in batch culture.

2.2初始麥芽糖質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶分批發(fā)酵過程的影響

在發(fā)酵過程中，菌體的生長受到底物質(zhì)量濃度的影響。當(dāng)培養(yǎng)基中的糖質(zhì)量濃度增加到一定量時(shí)，生長就顯示飽和型動(dòng)力學(xué)[17]，若進(jìn)一步增加糖質(zhì)量濃度，由于發(fā)酵液滲透壓過大，就對菌體的生長產(chǎn)生抑制，菌體比增長速率減小，菌濃度下降，影響菌體生長[18]。

考察了不同初始糖質(zhì)量濃度（20、25、30和35 g/L）下的菌體生長和產(chǎn)酶情況，結(jié)果如圖2所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，較高的初糖質(zhì)量濃度（30 g/L）較利于菌體的生長，最大DCW達(dá)到33.2 g/L，較低的初糖質(zhì)量濃度（25 g/L）較利于產(chǎn)酶，最高酶活達(dá)到444.7 U/L。因此，選擇初糖質(zhì)量濃度為25 g/L。

圖2　初始麥芽糖質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶分批發(fā)酵過程的影響Fig. 2 Influence of initial maltose concentration on the production of α-glucosidase in batch culture

2.3攪拌轉(zhuǎn)速對α-葡萄糖苷酶分批發(fā)酵過程的影響

溶解氧是影響微生物生長發(fā)酵的重要因素之一，它在細(xì)胞生長、產(chǎn)物形成和維持細(xì)胞的代謝中起著重要的作用[19]。

控制不同的攪拌轉(zhuǎn)速（500、600、700和800 r/ min）考察其溶氧情況，發(fā)現(xiàn)其在前期和中期需要大量溶解氧，對數(shù)期DO維持在20%以內(nèi)。從圖3可以看出，溶氧供給的不足會(huì)給菌體生長帶來負(fù)面影響，500 r/min時(shí)最大菌體干重比800 r/min時(shí)低44.6%。而菌株生長過快并不代表產(chǎn)酶能力的提高，600 r/min時(shí)最高酶活比800 r/min時(shí)高33.7%，且單位細(xì)胞產(chǎn)酶量比800 r/min時(shí)高（見表1）。因此，選擇攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min為初糖質(zhì)量濃度25 g/L時(shí)的最佳攪拌轉(zhuǎn)速。

2.4變速補(bǔ)加碳源對α-葡萄糖苷酶補(bǔ)料-分批發(fā)酵過程的影響

根據(jù)發(fā)酵過程中的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度，2～8 h內(nèi)糖消耗速率較快，至10 h時(shí)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度已經(jīng)將至1 g/L，而殘?zhí)菨舛染S持在18 g/L時(shí)產(chǎn)酶速率最大，故而提出以下幾種補(bǔ)料策略：

圖3　攪拌轉(zhuǎn)速對α-葡萄糖苷酶分批發(fā)酵過程的影響Fig. 3 Influence of agitation speed on the production of α-glucosidase in batch culture

4～8 h內(nèi)，補(bǔ)料速度恒定為8.25 mL/h；4～6 h內(nèi)，補(bǔ)料速度為4.5 mL/h：6～8 h內(nèi)，補(bǔ)料速度為12 mL/h；4～6 h內(nèi)，補(bǔ)料速度為4.5 mL/h；6～7 h內(nèi)，補(bǔ)料速度為9 mL/h；7～8 h內(nèi)，補(bǔ)料速度為15 mL/h；4～5 h內(nèi)，補(bǔ)料速度為2.25 mL/h；5～6 h內(nèi)補(bǔ)料速度為6.75 mL/h；6～7 h內(nèi)，補(bǔ)料速度為9 mL/h；7～8 h內(nèi)，補(bǔ)料速度為15 mL/h。

表1　不同3 L發(fā)酵罐控制條件對Bacillus licheniformis JXC-1生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的發(fā)酵參數(shù)比較Table 1 Comparison of fermentation parameters with different control conditions for the production of α-glucosidase from Bacillus licheniformis JXC-1 in batch culture

在補(bǔ)料-分批發(fā)酵過程中，碳源的流加方式對發(fā)酵有著重要影響。因?yàn)樘荚磪T乏時(shí)容易導(dǎo)致細(xì)胞沒有營養(yǎng)物質(zhì)可吸收而不能生長、繁殖或合成代謝產(chǎn)物，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡；而碳源濃度過高時(shí)，由于底物限制和過量代謝會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物的分泌[20]。因此，選擇合適補(bǔ)料方式對實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)強(qiáng)度發(fā)酵生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶至關(guān)重要。

在上述3 L發(fā)酵罐產(chǎn)酶關(guān)鍵因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采取4種補(bǔ)料策略在4～8 h內(nèi)進(jìn)行變速補(bǔ)加麥芽糖，菌體在2-4 h內(nèi)大量產(chǎn)酶，在4 h后添加碳源麥芽糖使穩(wěn)定期時(shí)間延長，至24 h后進(jìn)入衰亡期。補(bǔ)加碳源使得酶活和菌體干重都有所上升，菌體生長趨勢大致相同，采用策略D可得到最高酶活為633.8 U/L，生產(chǎn)強(qiáng)度及單位菌體胞內(nèi)產(chǎn)酶量在4種策略里為最高。而采用策略C可得到最大菌體干重45.6 g/L，可能是補(bǔ)加策略C相應(yīng)質(zhì)量濃度的麥芽糖利于菌體生長，使得產(chǎn)酶并沒有相應(yīng)幅度地提高。

2.5變速補(bǔ)加碳源和有機(jī)氮源對α-葡萄糖苷酶補(bǔ)料-分批發(fā)酵過程的影響

在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖苷酶的合成伴隨著菌體的生長。為了維持菌體最大生長速率，不僅要提供充足合適的碳源，其余菌體可利用的成分需要得到相應(yīng)的補(bǔ)充，來源于有機(jī)氮源的核苷酸、微量元素等對菌體生長很有必要[21]。

基于此，考察了采用上述4種策略同時(shí)補(bǔ)加碳源麥芽糖和氮源蛋白胨時(shí)菌株的生長和產(chǎn)酶情況，采用策略D補(bǔ)加可得到最高酶活為872.5 U/L，比未補(bǔ)加氮源前提高了37.7%，說明同時(shí)補(bǔ)加碳源和氮源是有效果的，而相較于僅流加碳源，采用策略A時(shí)流加碳氮源的效果比策略B和C都有效，可能是由于補(bǔ)加氮源使得菌體生長速度在補(bǔ)料前期得到了提高從而相應(yīng)增加了對碳氮源的需求.但由表2可知，策略D的生產(chǎn)強(qiáng)度和單位菌體胞內(nèi)產(chǎn)酶量都優(yōu)于策略A，故而，采用策略D補(bǔ)加碳源和有機(jī)氮源的效果最佳。

表2　不同碳源和氮源流加方式下Bacillus licheniformis JXC-1生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的發(fā)酵參數(shù)比較Table 2 Comparison of fermentation parameters with different carbon and organic nitrogen sources feeding approaches for the production of α-glucosidase from Bacillus licheniformis JXC-1 in fed-batch cultures

3　結(jié)語

在對產(chǎn)耐有機(jī)溶劑α-葡萄糖苷酶地衣芽孢桿菌JXC-1搖瓶發(fā)酵條件初步優(yōu)化的基礎(chǔ)上，于3 L發(fā)酵罐上研究了其產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素，結(jié)果表明：pH恒定7.0，初始糖濃度25 g/L，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min為最適產(chǎn)酶條件，酶活由104.6 U/L提高到了444.7 U/ L，提高了3.25倍。通過4種補(bǔ)料策略對其進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵研究，分別補(bǔ)加碳源麥芽糖及碳氮源麥芽糖與蛋白胨，得出：在4～5 h內(nèi)補(bǔ)料速度為2.25 mL/ h，5～6 h內(nèi)補(bǔ)料速度為6.75 mL/h，6～7 h內(nèi)補(bǔ)料速度為9 mL/h，7～8 h內(nèi)補(bǔ)料速度為15 mL/h補(bǔ)加麥芽糖與蛋白胨效果最好，此時(shí)酶活達(dá)到872.5 U/L，比未補(bǔ)料之前提高了96.2%，由此可見，采用該種補(bǔ)料策略補(bǔ)加碳源和有機(jī)氮源是提升Bacillus licheniformis JXC-1生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的有效途徑之一。

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Enhanced Production of Solvent-Stable Alpha Glycosidase from Bacillus licheniformis JXC-1 by an Optimal Feeding Strategy

TANG Qunfang1，2，LI Jianghua1，2，LIU Long*1，2，DU Guocheng1，2，CHEN Jian1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：In previous work，we screened a strain（Bacillus licheniformis JXC-1）producing solvent-stable（10% N，N-Dimethylformamide，short for DMF）α-glucosidase from several different soil samples. In this work，we attempted to determine the key factors for the production of α-glucosidase and optimize the feeding strategy in a 3-L fermenter. Results showed that the enzyme activity reached 444.7 U/L with the optimal condition（pH 7.0，the initial maltose concentration 25 g/L，and agitation speed 600 rpm）. The strategy of feeding maltose and tryptone at a rate of 2.25 mL/h（4-5 h），6.75 mL/h（5-6 h），9 mL/h（6-7 h）and 15 mL/h（7-8 h）significantly increased the production of α-glycosidase from 444.7 U/L to 872.5 U/L.

Keywords：Bacillus licheniformis JXC-1，alpha glycosidase，fed-batch fermentation，solvent-stable enzymes

*通信作者：劉龍（1980—），男，山東渚城人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵過程優(yōu)化與控制研究。E-mail：longliu@jiangnan.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21006040）；國家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB720802，2012CB720806）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

收稿日期：2014-09-18

中圖分類號：Q 814

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0012—07