軒亞茹，應(yīng) 雪，張春春，王亞華，閆荷露，李 霞

832000新疆石河子市，石河子大學(xué)藥學(xué)院特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

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·論著·

表阿霉素與替莫唑胺聯(lián)合應(yīng)用對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡作用

軒亞茹，應(yīng) 雪，張春春，王亞華，閆荷露，李 霞

832000新疆石河子市，石河子大學(xué)藥學(xué)院特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

【摘要】目的探討表阿霉素(EPI)與替莫唑胺(TMZ)聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和細(xì)胞腫瘤球的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。方法培養(yǎng)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞活性>95%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，24 h后加入各藥液10 μl至細(xì)胞培養(yǎng)孔中，細(xì)胞培養(yǎng)孔中EPI濃度梯度為0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 μmol/L，TMZ的濃度梯度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。采用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度(OD)值，計(jì)算各孔C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率。取C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于6孔板中，加入EPI、TMZ、EPI+TMZ(EPI終濃度為0.50、1.00、5.00 μmol/L，TMZ終濃度為1.0、5.0、10.0 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPI和TMZ聯(lián)合對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡作用。培養(yǎng)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球，加入EPI、TMZ、EPI+TMZ，EPI終濃度為5.00 μmol/L，TMZ的終濃度為10.0 μmol/L，分別于給藥后0、1、3、7 d于倒置顯微鏡下觀察腫瘤球的形態(tài)、球體是否有裂解、球核是否有壞死等現(xiàn)象。結(jié)果不同濃度的各藥物在24、48 h對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各濃度EPI+TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制率均高于相同EPI或TMZ濃度下單獨(dú)用藥，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)至24 h時(shí)，1.00 μmol/L EPI與5.0 μmol/L TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率呈協(xié)同作用；培養(yǎng)至48 h時(shí)，0.50 μmol/L EPI與1.0 μmol/L TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率呈協(xié)同作用。培養(yǎng)至24、48 h時(shí)，陰性對(duì)照、各濃度的EPI、TMZ及EPI+TMZ對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)EPI、TMZ及其聯(lián)合用藥后腫瘤球體積明顯受到抑制，表現(xiàn)為體積縮小，表面細(xì)胞裂解；聯(lián)合用藥較單獨(dú)用藥后腫瘤球球體致密性減小，裂解程度增大。結(jié)論EPI和TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有協(xié)同抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，可引起C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球的裂解死亡。

【關(guān)鍵詞】神經(jīng)膠質(zhì)瘤；表柔比星；替莫唑胺；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

軒亞茹，應(yīng)雪，張春春，等.表阿霉素與替莫唑胺聯(lián)合應(yīng)用對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡作用[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(8)：925-930.[www.chinagp.net]

Xuan YR，Ying X，Zhang CC，et al.Effect of the combined use of epirubicin and temozolomide in the proliferation and apoptosis of C6 glioma cells[J].Chinese General Practice，2016，19(8)：925-930.

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，預(yù)后較差，平均生存時(shí)間僅14.6個(gè)月，其中5年生存率不超過(guò)5%[1-2]。表阿霉素(EPI)是高效廣譜蒽環(huán)類衍生物抗腫瘤藥，主要作用機(jī)制是嵌入DNA鏈，形成抑制DNA和RNA合成的復(fù)合物，通過(guò)觸發(fā)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ引起DNA裂解，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3-4]。EPI已在臨床上用于治療乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、軟組織肉瘤、胰腺癌、胃癌、小細(xì)胞肺癌和白血病[5-7]，已有研究表明，其對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有很好的抑制效果[8]。與阿霉素相比，EPI在可比劑量下表現(xiàn)出更小的血液和心肌毒性[9-10]。替莫唑胺(TMZ)是一類含有咪唑四嗪環(huán)的烷化劑抗腫瘤藥物，通過(guò)鳥(niǎo)嘌呤的O-6或N-7位上發(fā)生的DNA烷基化作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[11]。臨床治療腦膠質(zhì)瘤的效果顯著[12-14]。目前，對(duì)EPI與TMZ聯(lián)合應(yīng)用治療腦膠質(zhì)瘤的研究報(bào)道較少。本研究旨在探討體外EPI聯(lián)合TMZ用藥對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以及對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球的抑制作用，為臨床腦腫瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1儀器和試劑CO2恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo科技有限公司)，臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(FACSAria Ⅲ，美國(guó)BD公司)，酶標(biāo)免疫測(cè)定儀(上?；蚩萍加邢薰?，SartoriusBP211D電子天平(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)，0.25%胰酶(美國(guó)Gibco公司)，雙抗(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)，PBS緩沖溶液(上海生工科技有限公司)，磺酰羅丹明B蛋白(SRB，美國(guó)Sigma公司)；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.2細(xì)胞株及培養(yǎng)條件C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為：DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期活性>95%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3方法

1.3.1體外抗增殖作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔3 000個(gè)(含190 μl培養(yǎng)液)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入各藥液10 μl至細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每種藥液濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)溶劑對(duì)照4個(gè)復(fù)孔。各藥液分別為用無(wú)血清培養(yǎng)液配制的系列濃度的EPI、TMZ、EPI+TMZ，細(xì)胞培養(yǎng)孔中EPI的濃度梯度為0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 μmol/L，TMZ的濃度梯度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L。將加好各藥液的細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。培養(yǎng)完畢后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入4 ℃預(yù)冷的10%(W/V)三氯乙酸100 μl，靜置5 min后移入4 ℃冰箱中固定1 h，取出用去離子水沖洗5次，室溫晾干。每孔加入0.4% SRB染液100 μl，室溫下染色15 min，棄去各孔內(nèi)染液，用1%(V/V)乙酸沖洗5次，室溫晾干后，用非緩沖Tris-base堿液(10 mmol/L，pH=10.5)溶解，在平板振蕩器上振蕩20 min，采用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度(OD)值，計(jì)算各孔C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率，抑制率(%)=〔1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)〕×100%。

1.3.2藥物聯(lián)合作用評(píng)價(jià)[15]參照公式Q=Ee+t/(Ee+Et-Ee×Et)評(píng)價(jià)EPI和TMZ體外聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞毒性是否具有協(xié)同作用，其中Ee+t為聯(lián)合用藥抑制率，Ee和Et分別為EPI和TMZ的抑制率，分子代表“實(shí)測(cè)合并效應(yīng)”，分母是“期望合并效應(yīng)”。Q值0.86～1.15為單純相加作用(+)，Q值1.16～2.00為協(xié)同作用(++)，Q值0.55～0.85為拮抗作用(-)，Q值<0.55為明顯拮抗作用(--)。

1.3.3凋亡作用采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPI和TMZ聯(lián)合對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，接種于6孔板中，接種密度為2×105個(gè)/孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h后，加入無(wú)血清培養(yǎng)液以及無(wú)血清培養(yǎng)液配置的EPI、TMZ、EPI+TMZ(EPI終濃度為0.50、1.00、5.00 μmol/L，TMZ終濃度為1.0、5.0、10.0 μmol/L)，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h。每組藥物設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以無(wú)血清培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。培養(yǎng)完畢后，用冷PBS漂洗3次，不含EDTA的胰酶消化；1 000 r/min離心5 min后用PBS洗滌細(xì)胞2次；用300 μl的PBS將離心的下沉細(xì)胞吹勻，依次加入500 μl的Binding Buffer、5 μl Annexin V-APC、5 μl 7-AAD，混勻后于室溫避光的條件下反應(yīng)10 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.4C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球的培養(yǎng)[16]配制2%(W/V)的瓊脂糖凝膠溶液，在80 ℃的水浴中加熱30 min，過(guò)濾滅菌；將150 μl C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種到96孔培養(yǎng)板中(該培養(yǎng)板中的每孔均預(yù)先加入40 μl瓊脂糖凝膠溶液包被)，在操作臺(tái)中輕輕晃動(dòng)該培養(yǎng)板30 min，置37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，即可長(zhǎng)成腫瘤球。

1.3.4.2藥物對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球的抑制用無(wú)血清培養(yǎng)液配置EPI、TMZ、EPI+TMZ，每孔給藥體積為20 μl，EPI終濃度為5.00 μmol/L，TMZ的終濃度為10.0 μmol/L，以無(wú)血清培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。分別于給藥后0、1、3、7 d于倒置顯微鏡下觀察腫瘤球的形態(tài)、球體是否有裂解、球核是否有壞死等現(xiàn)象。

2結(jié)果

2.1體外抗增殖作用不同濃度的各藥物在24、48h對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各濃度EPI+TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制率均高于相同EPI或TMZ濃度下單獨(dú)用藥，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1不同藥物對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率的比較

Table1ComparisonofproliferationinhibitionrateofC6gliomacellsamongdifferentdrugs

藥物濃度(μmol/L)抑制率24h 48hEPI0.053.71±0.525.38±1.340.107.74±1.2413.97±1.320.5011.63±0.2228.56±1.281.0022.43±0.8649.40±0.755.0041.89±1.8562.85±1.2810.0061.20±1.9881.99±2.55TMZ0.11.60±0.173.53±0.270.55.79±0.7113.83±1.921.09.94±0.9124.74±1.345.030.30±0.3051.43±1.3410.040.03±0.6463.62±1.7820.053.58±1.3973.65±1.66EPI+TMZ0-1.97±0.59-1.11±0.150.05+0.15.85±1.10ab6.47±1.800.10+0.512.53±2.42ab22.08±1.43ab0.50+1.021.64±2.18ab52.14±1.63ab1.00+5.054.11±3.16ab73.33±1.90ab5.00+10.073.29±2.62ab86.54±2.39ab10.00+20.090.48±2.66ab98.25±1.32abF值936.25535.25P值<0.001<0.001

注：EPI=表阿霉素，TMZ=替莫唑胺；與同一濃度EPI比較，aP<0.05；與同一濃度TMZ比較，bP<0.05

2.2兩藥聯(lián)合作用培養(yǎng)至24 h時(shí)，0.05 μmol/L EPI與0.1 μmol/L TMZ、0.10 μmol/L EPI與0.5 μmol/L TMZ、0.50 μmol/L EPI與1.0 μmol/L TMZ、5.00 μmol/L EPI與10.0 μmol/L TMZ、10.00 μmol/L EPI與20.0 μmol/L TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率呈相加作用，1.00 μmol/L EPI與5.0 μmol/L TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率呈協(xié)同作用；培養(yǎng)至48 h時(shí)，0.05 μmol/L EPI與0.1 μmol/L TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率呈拮抗作用，0.10 μmol/L EPI與0.5 μmol/L TMZ、1.00 μmol/L EPI與5.0 μmol/L TMZ、5.00 μmol/L EPI與10.0 μmol/L TMZ、10.00 μmol/L EPI與20.0 μmol/L TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率呈相加作用，0.50 μmol/L EPI與1.0 μmol/L TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制率呈協(xié)同作用(見(jiàn)表2)。

表2　EPI與TMZ對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的聯(lián)合作用

注：++表示協(xié)同作用，+表示相加作用，-表示拮抗作用

2.3凋亡作用培養(yǎng)至24 h時(shí)，陰性對(duì)照、各濃度的EPI、TMZ及EPI+TMZ對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，1.00 μmol/L和5.00 μmol/L EPI、5.0 μmol/L和10.0 μmol/L TMZ及各濃度的EPI+TMZ對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照，1.00 μmol/L EPI和5.0 μmol/L TMZ、5.00 μmol/L EPI和10.0 μmol/L TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率均高于同一濃度的EPI、TMZ單獨(dú)用藥，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)至48 h時(shí)，陰性對(duì)照、各濃度的EPI、TMZ及EPI+TMZ對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，1.00 μmol/L和5.00 μmol/L EPI、5.0 μmol/L和10.0 μmol/L TMZ及各濃度的EPI+TMZ對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率高于陰性對(duì)照，各濃度聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率均高于同一濃度的EPI、TMZ單獨(dú)用藥，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

表3EPI、TMZ及其聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率的比較

Table3ComparisonofapoptosisrateofC6gliomacellsbetweenEPIorTMZaloneandEPI+TMZ

干預(yù)濃度(μmol/L)凋亡率24h 48h陰性對(duì)照-4.67±1.035.29±0.89EPI0.505.96±1.027.17±1.441.0011.73±0.87a16.10±1.32a5.0026.86±1.55a35.18±1.65aTMZ 1.0 5.09±1.575.84±1.30 5.0 9.22±1.09a14.04±1.41a10.023.43±3.01a30.67±2.22aEPI+TMZ0.50+1.07.78±1.39a11.27±1.68abc1.00+5.026.59±0.93abc31.96±1.74abc5.00+10.038.19±1.73abc56.50±2.49abcF值176.63290.90P值<0.001<0.001

注：與陰性對(duì)照比較，aP<0.01；與同一濃度EPI比較，bP<0.05；與同一濃度TMZ比較，cP<0.05

2.4C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球的生長(zhǎng)抑制作用陰性對(duì)照C6腦膠質(zhì)瘤腫瘤球細(xì)胞生長(zhǎng)致密，增殖速度較快，腫瘤體積隨培養(yǎng)時(shí)間明顯增大。經(jīng)EPI、TMZ及其聯(lián)合用藥后腫瘤球體積明顯受到抑制，表現(xiàn)為體積縮小，表面細(xì)胞裂解；聯(lián)合用藥較單獨(dú)用藥后腫瘤球球體致密性減小，裂解程度增大(見(jiàn)圖1，本文彩圖請(qǐng)登錄本刊官網(wǎng)www.chinagp.net查看)。

3討論

腦膠質(zhì)瘤為常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，約占腦腫瘤患者的50%，由于其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，無(wú)明顯邊界，手術(shù)不能完全根除，導(dǎo)致臨床治愈率低，生存期短，病死率高，其中惡性腦膠質(zhì)瘤患者5年生存率不足5%，病死率僅次于胰腺癌和肺癌，位居第3位[17-18]。化療作為腦膠質(zhì)瘤手術(shù)后的輔助治療，為清除殘余腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤復(fù)發(fā)提供可能。因此，開(kāi)發(fā)對(duì)腦膠質(zhì)瘤的治療敏感有效、毒副作用小且經(jīng)濟(jì)適用的新的化療方案成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。

TMZ是目前臨床一線腦膠質(zhì)瘤化療藥物，易于通過(guò)血-腦脊液屏障，能使腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA烷基化，發(fā)揮其細(xì)胞毒作用[19]。EPI為一種作用于細(xì)胞周期的非特異性藥物，是目前一線抗腫瘤藥物，對(duì)多種實(shí)體瘤有效，其作用部位在細(xì)胞核，作用機(jī)制主要為進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，從而抑制核酸的合成和有絲分裂，引起細(xì)胞凋亡[20-21]。

本研究采用EPI聯(lián)合TMZ作用于C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，表現(xiàn)出較單獨(dú)用藥更強(qiáng)的抗增殖和促凋亡作用，且受時(shí)間和劑量的影響。培養(yǎng)24 h時(shí)，EPI(1.00 μmol/L)和TMZ(5.0 μmol/L)聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制表現(xiàn)為協(xié)同增強(qiáng)作用；培養(yǎng)48 h時(shí)，EPI(0.50 μmol/L)和TMZ(1.0 μmol/L)聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制表現(xiàn)為協(xié)同增強(qiáng)的作用，提示聯(lián)合用藥低劑量作用較長(zhǎng)時(shí)間或高劑量作用較短時(shí)間均可增強(qiáng)對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抗增殖作用。當(dāng)聯(lián)合用藥劑量提高到EPI(5.00 μmol/L)和TMZ(10.0 μmol/L)，在24、48 h時(shí)抑制率分別為73%和86%，凋亡率分別為38%和56%，可能因?yàn)榻o藥濃度較高引起細(xì)胞死亡增加。聯(lián)合用藥后的抗增殖和促凋亡增強(qiáng)作用可能是因?yàn)镋PI和TMZ能夠分別迅速進(jìn)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞及細(xì)胞核內(nèi)，與DNA結(jié)合[22]或使DNA烷基化[23-24]，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，引起細(xì)胞的凋亡甚至死亡。

然而，大多數(shù)腦腫瘤為實(shí)體瘤，腫瘤內(nèi)的無(wú)血管區(qū)域能夠阻止藥物滲透到腫瘤的中心部位[25]。體外單層細(xì)胞的作用很強(qiáng)未必對(duì)體內(nèi)實(shí)體瘤同樣有效。與單層細(xì)胞的培養(yǎng)不同，神經(jīng)膠質(zhì)瘤體外三維球體模型(簡(jiǎn)稱腫瘤球)可模擬實(shí)體瘤的無(wú)血管區(qū)域，更接近于體內(nèi)腫瘤的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和環(huán)境[26]。通過(guò)評(píng)估藥物體外對(duì)腫瘤球的抑制作用，從而預(yù)測(cè)其在體內(nèi)對(duì)腫瘤的抑制效果[27]。本研究接種細(xì)胞后向同一方向晃動(dòng)培養(yǎng)板，可將大部分細(xì)胞集中到培養(yǎng)板的中心位置，晃動(dòng)時(shí)間過(guò)短，培養(yǎng)后形成多個(gè)分散的小聚集，無(wú)法對(duì)其定位拍照，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示晃動(dòng)25～30 min時(shí)，24 h后96孔板的大部分孔內(nèi)只在中央位置形成一個(gè)大的細(xì)胞聚集，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，聚集的細(xì)胞生長(zhǎng)越緊密，形狀更加接近球形；預(yù)先向96孔板內(nèi)加入2%瓊脂糖可為球體的形成提供骨架支撐，使細(xì)胞生長(zhǎng)更為致密、行成的球體更加圓整。作用7 d后，陰性對(duì)照腫瘤球表面有輕微裂解，可能是由于培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、球體過(guò)大，周圍環(huán)境不足以提供細(xì)胞快速增殖需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而引起腫瘤球表面細(xì)胞死亡裂解[28-29]。與干預(yù)3 d后比較，EPI、TMZ單獨(dú)用藥7 d后腫瘤球變化不明顯，分析原因可能為：(1)腫瘤球生長(zhǎng)致密，藥物無(wú)法滲透到球體內(nèi)部；(2)單獨(dú)給藥作用較弱，只能引起腫瘤球表面細(xì)胞的死亡；(3)單次給藥作用3～7 d，藥物濃度下降，過(guò)低的濃度不足以使細(xì)胞凋亡。隨時(shí)間延長(zhǎng)，EPI+TMZ聯(lián)合用藥干預(yù)的腫瘤球裂解比較明顯，但7 d時(shí)球體中間部分仍很致密，繼續(xù)(多次)給藥可能使腫瘤球進(jìn)一步裂解，直至球體完全裂解。本研究的結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照、EPI及TMZ單獨(dú)用藥比較，EPI+TMZ聯(lián)合用藥更能有效地滲透至腫瘤球內(nèi)部，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，減小腫瘤體積，預(yù)示臨床上EPI聯(lián)合TMZ用于治療腦膠質(zhì)瘤的可能性，提示一定濃度下多次給藥，對(duì)實(shí)體腫瘤的治療更為有效。

注：A0、A1、A3、A7分別為陰性對(duì)照干預(yù)后第0、1、3、7天，B0、B1、B3、B7分別為EPI干預(yù)后第0、1、3、7天，C0、C1、C3、C7分別為T(mén)MZ干預(yù)后第0、1、3、7天，D0、D1、D3、D7分別為EPI+TMZ干預(yù)后第0、1、3、7 d天；圖中標(biāo)尺為100 μm

圖1EPI、TMZ及其聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤球的抑制作用(×100)

Figure 1Inhibiting effect of EPI，TMZ and EPI+TMZ on C6 glioma spheroids

本研究探討了EPI及TMZ聯(lián)合用藥對(duì)C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用，為臨床腦膠質(zhì)瘤的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)，但其復(fù)雜的聯(lián)合作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：軒亞茹進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；張春春、王亞華、閆荷露、李霞進(jìn)行課題實(shí)施、評(píng)估、資料收集；應(yīng)雪進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Effect of the Combined Use of Epirubicin and Temozolomide in the Proliferation and Apoptosis of C6 Glioma Cells

XUANYa-ru，YINGXue，ZHANGChun-chun，etal.

KeyLaboratoryofXinjiangPhytomedicineResourcesandModernizationofTCM，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of the combined used of epirubicin(EPI) and temozolomide(TMZ) on the proliferation and apoptosis of C6 glioma cells and C6 glioma spheroids.MethodsTo carry out the experiments，we used C6 glioma cells which were in the logarithmic phase and their cell activity was more than 95%.These C6 glioma cells were seeded into 96-well culture plates for 24 h.Then EPI and TMZ were severally added into 96-well culture plates with 10μl each and the concentration gradients were 0.05，0.10，0.50，1.00，5.00，10.00 μmol/L and 0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μmol/L，respectively.24 h and 48 h later，the absorbance was read on a microplate reader at 540 nm.The inhibition rate of C6 glioma cells in each hole was calculated after the above process.C6 glioma cells were seeded into 6-well culture plates and then EPI，TMZ and EPI+TMZ were added and the final concentrations of EPI were 0.50，1.00，5.00 μmol/L and those of TMZ were 1.0，5.0，10.0 μmol/L，respectively.After continuous culture for 24 h and 48 h，the apoptosis effect of EPI combined with TMZ was determined by flow cytometry.C6 glioma spheroids in vitro were developed and then EPI，TMZ，EPI+TMZ were added and the final concentrations of EPI and TMZ were 5.00 μmol/L and 10.0 μmol/L respectively.On the 0，1，3，7 d after adding the drugs，we used the inverted microscope to observe the morphologic changes of C6 glioma spheroids to see if the spheroids produced splitting decomposition and the spheroids nuclear had necrosis.ResultsThe inhibition rates of C6 glioma cells were significantly different among the drugs of different concentrations at 24 h and 48 h(P<0.05);the inhibition rates of EPI+TMZ were significantly higher than EPI or TMZ alone under the same concentration(P<0.05).The inhibition rates of C6 glioma cells showed synergy after adding 1.00 μmol/L EPI combined with 5.0 μmol/L TMZ at 24 h and 0.50 μmol/L EPI combined with 1.0 μmol/L TMZ at 48 h.At 24 h and 48 h，significant differences existed in the apoptosis rate of C6 glioma cells among negative control group and EPI，TMZ and EPI+TMZ groups of different concentrations(P<0.05).EPI，TMZ and EPI+TMZ evidently inhibited the volume of tumor spheres，with specific manifestations of shrinking volume and cell disruption on the surface;EPI+TMZ more obviously reduced the compactness of tumor spheres and caused greater splitting decomposition than EPI or TMZ alone.ConclusionThe combined application of EPI and TMZ could produce a significant synergic effect on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of C6 glioma cells，and result in pyrolysis or death of C6 glioma spheroids.

【Key words】Glioma ；Epirubicin；Temozolomide；Cell proliferation；Apoptosis

(收稿日期：2015-10-20；修回日期：2016-01-22)

【中圖分類號(hào)】R 730.264

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.08.013

通信作者：應(yīng)雪，832000新疆石河子市，石河子大學(xué)藥學(xué)院特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；E-mail：yingxue2011@qq.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160396，81460540)；石河子大學(xué)杰出青年科技人才培育計(jì)劃項(xiàng)目(2012ZRKXJQ07)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目(2015AD007)；石河子大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(SRP2015256)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510759066)