顧珮馨 殷愛(ài)玲

摘要：目的建立同時(shí)測(cè)定雙黃連口服液中連翹苷、牛蒡子苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙4種有效成分含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析方法。方法采用UPLC-MS/MS技術(shù)結(jié)合BEHC18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱建立分析方法。利用乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫作為流動(dòng)相，流速為0.4 mL·min-1，采用電噴霧電離源（ESI），多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）掃描方式進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果4種被測(cè)物呈良好的線性關(guān)系（r>0.999）；精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好；加樣回收率在99.12%～101.40%之間，RSD值均小于3%。結(jié)論 所建立的方法準(zhǔn)確、快捷，重現(xiàn)性好，可用于雙黃連口服液中連翹苷、牛蒡子苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙4種有效成分的含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；雙黃連口服液；木脂素；皂苷類

中圖分類號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2016）05-0056-03

雙黃連口服液是由黃芩、金銀花、連翹通過(guò)一定傳統(tǒng)水提醇沉工藝精制而成，臨床主要用于細(xì)菌或病毒引起的上呼吸道感染。前期研究表明金銀花、連翹為方解雙黃連君藥，其抗菌、抗病毒效果顯著[1-2]。連翹苷、牛蒡子苷為連翹有效微量成分[3]。而灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙為金銀花有效微量成分[4-5]。由于HPLC-UV-ELSD分析條件的限制，使雙黃連口服液中這些微量成分無(wú)法追蹤。近些年，隨著質(zhì)譜（MS）技術(shù)的發(fā)展。LC-MS技術(shù)用于中藥質(zhì)量控制越來(lái)越多。本研究采用LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，快速測(cè)定了雙黃連口服液中4種有效微量成分的含量，該方法具有準(zhǔn)確、快捷、精密度高、靈敏性好等特點(diǎn)，為雙黃連制劑提供了一種簡(jiǎn)單易行的定量方法，可用于該制劑的質(zhì)量控制和臨床研究。

1儀器與試劑

1.1儀器設(shè)備超高效液相色譜-TQD質(zhì)譜聯(lián)用儀（ACQUITY系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司），MassLynx V4.1工作站。BP211D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司），MicroCL 21R微量離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），微量移液器（上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司），默克密理博Synergy超純水儀（德國(guó)Merck公司）。

1.2藥品與試劑對(duì)照品牛蒡子苷、連翹苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙（成都瑞芬思生物科技有限公司）均為供含量測(cè)定用，雙黃連口服液為哈藥制藥三廠生產(chǎn)，批號(hào)分別為12022231，10080188，13021633。甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司），其余溶劑均為分析純，水為超純水。

2分析方法

2.1色譜條件色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%的甲酸水；梯度洗脫：0～1.5 min（90%B（90%B），1.5～4.0 min（90%B（40%B），4.0～4.2 min（40%B（10%B），4.2～5.2 min（10%B（10%B），5.2～7 min（10%B（90%B），7.0～8.0 min（90%B（90%B）；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL，柱溫40 ℃。見(jiàn)圖1。

2.2質(zhì)譜條件Waters三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（TQD），離子化方式：電噴霧離子化（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描模式（MRM）測(cè)定；主要質(zhì)譜參數(shù)為：毛細(xì)管電壓4KV，錐孔電壓60V，脫溶劑溫度450℃，脫溶劑氣體流速800L·Hr-1。四種成分離子對(duì)的選擇（M/Z）：連翹苷：（ESI+，556.91>309.05），牛蒡子苷：（ESI+，556.91>395.06），灰氈毛忍冬皂苷乙：（ESI+，1421.44>1097.64），川續(xù)斷皂苷乙：（ESI+，[FL）]

2.3溶液的配制

2.3.1供試品溶液的制備取雙黃連口服液1 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇20 mL，超聲（35kHz）處理20分鐘，放置至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。12，000 r/min離心10 min，取上清。用10%（乙腈：甲醇（4：1））含0.4%甲酸及0.5 mM甲酸鈉溶液稀釋50倍，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，取上清液5 μL，UPLC-ESI-MS/MS分析。

2.3.2混合對(duì)照品溶液的制備精密稱取牛蒡子苷、連翹苷、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品適量，用甲醇（0.1%甲酸）制成每1 mL含牛蒡子苷1.10 μg，連翹苷2.29 μg，灰氈毛忍冬皂苷乙4.81 μg，川續(xù)斷皂苷乙3.89 μg。4℃保存，備用。

3方法學(xué)考察

3.1線性關(guān)系與定量限分別精密量取“2.4.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，置于10 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水（1：9，v/v）稀釋成系列濃度的混合對(duì)照品溶液（牛蒡子苷：1100，550，275，137.5，68.75，34.38，17.19，8.59，4.30，2.15 ng·mL-1；連翹苷：2290，1145，572.5，286.25，143.13，71.56，35.78，17.89，8.95，4.47 ng·mL-1；灰氈毛忍冬皂苷乙：4810，2405，1202.5，601.25，300.63，150.31，75.16，37.58，18.79，9.39 ng·mL-1；川續(xù)斷皂苷乙：3890，1945，972.5，486.25，243.13，121.56，60.78，30.39，15.20，7.60 ng·mL-1）。按照“2.1和2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣5 μL測(cè)定。以被測(cè)組分的質(zhì)量濃度X（ng·ml-1）為橫坐標(biāo)，以各成分的分子離子峰峰面積均值 Y 為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，以信噪比（S/N）為10來(lái)確定各待測(cè)組分的定量限。表1顯示牛蒡子苷在4.30-1101.00 ng·mL-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.9998，連翹苷在44.17-1413.00 ng·mL-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.9952，灰氈毛忍冬皂苷乙在9.39-4908.00 ng·mL-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.9994，川續(xù)斷皂苷乙在3.79-3885.00 ng·mL-1范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.9990。且定量限分別為0.54，5.52，4.70，0.95 ng·mL-1。以上結(jié)果表明各成分在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且定量限較低。

3.2精密度考察取供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定。結(jié)果顯示，牛蒡子苷、連翹苷、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值分別為2.43，3.05，3.67，3.09%。結(jié)果（表2）表明該方法的精密度良好。

3.3重復(fù)性考察按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品（12022231）6份，，按“2.1和2.2”條件進(jìn)樣分析，測(cè)得此批號(hào)中牛蒡子苷、連翹苷、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙平均含量分別為7.40，635.40，32.11，137.20 μg/mL。RSD值分別為1.53，2.10，1.98，2.11%，結(jié)果（表2）表明該方法的重復(fù)性良好。

3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得牛蒡子苷、連翹苷、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙峰面積的RSD值分別為3.97，3.63，3.93，4.24%。結(jié)果（表2）表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密吸取已知濃度的供試品溶液9等份，每3份為一組，分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算各成分的回收率。本方法在加樣3個(gè)濃度水平下，四種成分的加樣回收率在95.00%～105%之間，RSD值均小于3%，能夠滿足雙黃連口服液中四種有效成分的含量測(cè)定要求。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.6樣品含量測(cè)定取3個(gè)批號(hào)的雙黃連口服液，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，平行制得各組待測(cè)樣品溶液3份，進(jìn)樣分析，經(jīng)計(jì)算得牛蒡子苷，連翹苷，灰氈毛忍冬皂苷乙，川續(xù)斷皂苷乙的含量。具體見(jiàn)表4。

[HT64結(jié)論

4.1雙黃連口服液的化學(xué)成分研究甚多，但多集中于運(yùn)用HPLC[6]技術(shù)來(lái)檢測(cè)并追蹤化學(xué)成分，并對(duì)制劑中具較強(qiáng)紫外吸收且含量較高的成分進(jìn)行定量分析，但對(duì)弱紫外吸收，含量較低且較難分離的成分含量測(cè)定分析時(shí)則相對(duì)困難。作者經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前尚未見(jiàn)到報(bào)道用液-質(zhì)串聯(lián)的方法同時(shí)檢測(cè)雙黃連口服液中多種微量成分含量的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)首次使用LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，對(duì)雙黃連口服液中多種微量成分進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定。方法簡(jiǎn)單、可靠、應(yīng)用性強(qiáng)。

4.2本實(shí)驗(yàn)同時(shí)選用正離子模式測(cè)定4種成分的含量，且分子離子峰均為[M+Na]+。實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)這四種物質(zhì)[M+Na]+豐度強(qiáng)且穩(wěn)定。MS/MS亦發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定且靈敏度高。

4.3本實(shí)驗(yàn)建立的液-質(zhì)聯(lián)用方法，可在短時(shí)間內(nèi)快速分離檢測(cè)雙黃連口服液中牛蒡子苷、連翹苷、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙4種微量成分，該方法經(jīng)考察，準(zhǔn)確，快捷，重現(xiàn)性好，符合中藥制劑的相關(guān)分析要求，可用于雙黃連口服液的質(zhì)量控制。此外，雙黃連口服液的體內(nèi)研究相對(duì)較少，隨著液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的不斷普及，雙黃連口服液物質(zhì)基礎(chǔ)研究包括體內(nèi)研究也將越來(lái)越多。本實(shí)驗(yàn)為雙黃連口服液的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，且為該制劑的臨床前與臨床藥代動(dòng)力學(xué)等相關(guān)研究提供了一定的參考。

4.4中藥制劑定性、定量研究最初為單一指標(biāo)性成分，隨著以色譜質(zhì)譜聯(lián)用為代表（LC-MS/MS）的各種分析儀器、分離手段和計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅速發(fā)展，目前，中藥制劑化學(xué)成分定[LL]性、定量研究已經(jīng)廣泛采用多指標(biāo)成分，為闡明中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了重要手段[7]。由此可見(jiàn)，不斷應(yīng)用新理論、新方法和新技術(shù)將會(huì)有力的推動(dòng)中藥的現(xiàn)代研究，大大加快對(duì)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制的研究。[KH*1D]

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