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        二磷酸鹽誘導(dǎo)人骨巨細(xì)胞瘤單核基質(zhì)細(xì)胞凋亡中的電鏡應(yīng)用

        2016-05-14 16:25:57項(xiàng)東全王小勇
        醫(yī)學(xué)信息 2016年9期
        關(guān)鍵詞:凋亡電鏡細(xì)胞培養(yǎng)

        項(xiàng)東全 王小勇

        摘要:目的 通過電鏡技術(shù)研究二磷酸鹽對(duì)體外人骨巨細(xì)胞瘤(GCT)單核基質(zhì)細(xì)胞(Stc)影響后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化,為GCT新的輔助治療方案的確立提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 用膠原酶-Ⅱ消化法體外分離培養(yǎng)8例新鮮GCT標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)獲得原代Stc并進(jìn)行傳代;電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 二磷酸鹽作用48 h(100 μmol/L)后電鏡觀察到細(xì)胞胞質(zhì)濃縮、核凝聚、核碎裂和凋亡小體形成。結(jié)論 在一定濃度范圍內(nèi),二磷酸鹽可抑制人GCT單核基質(zhì)細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,電鏡技術(shù)在研究二磷酸鹽對(duì)人GCT中Stc體外誘導(dǎo)凋亡研究中具有重要價(jià)值。

        關(guān)鍵詞:電鏡;二磷酸鹽;骨巨細(xì)胞瘤;單核基質(zhì)細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng);凋亡

        骨巨細(xì)胞瘤(GCT)是一種常見的具有潛在惡性的骨腫瘤,約占骨腫瘤發(fā)病的14%~16%[1],多發(fā)生于干骺端,具有局部侵襲性破壞骨質(zhì)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在惡性特征。目前多數(shù)GCT的治療是病灶刮除加植骨,但其復(fù)發(fā)率很高。本實(shí)驗(yàn)通過電鏡技術(shù)觀察二膦酸鹽對(duì)人Stc增殖和凋亡的影響。

        1 資料與方法

        1.1一般資料 標(biāo)本來源8例長(zhǎng)骨骨巨細(xì)胞瘤手術(shù)標(biāo)本由山西醫(yī)科大學(xué)附屬二院骨病科提供。所有標(biāo)本均經(jīng)病理切片診斷核實(shí)。

        1.2方法

        1.2.1骨巨細(xì)胞瘤單核基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化,在無菌條件下取骨巨細(xì)胞瘤質(zhì)脆軟的部分(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm),用含青霉素(1 g/l)和鏈霉素(1 g/l)的無菌PBS液中浸泡3遍,至顏色淡白,在含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中用眼科小剪刀輕輕剪碎,加入現(xiàn)配好的膠原酶Ⅱ(10 mg/ml)1 ml,吹吸數(shù)十次后,放入37℃水浴箱中,孵育50 min,然后使用200目濾網(wǎng)過濾,加入6~8 ml含15%胎牛血清DMEM,4℃ 1000 r/min離心10 min,棄去上清液,加入3~4 ml含15%胎牛血清的DMEM,吹打均勻,將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放入37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中8 h,棄去未貼壁細(xì)胞懸液,無菌PBS清洗2次,胰酶消化1~2 min,加入含15%胎牛血清的DMEM,吹打均勻后放入孵箱,重復(fù)2~3次可以達(dá)到純化。

        1.2.2倒置顯微鏡觀察 培養(yǎng)過程中,定期用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀況:分離培養(yǎng)的瘤細(xì)胞,在純化以前可見大量未貼壁的血細(xì)胞,和少部分貼壁的多核巨細(xì)胞,胰酶消化2~3次后,多核巨細(xì)胞變少甚至消失。純化的單核基質(zhì)細(xì)胞呈上皮形,梭形或多角形,排列成束狀或漩渦狀,4~5 d長(zhǎng)滿傳代,2~3 d換液。其中2例作長(zhǎng)期培養(yǎng),可以傳25~30代,為期100 d。

        1.2.3二膦酸鹽對(duì)體外GCT單核基質(zhì)細(xì)胞的影響

        1.2.3.1普通光學(xué)顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)變化。

        1.2.3.2透射電鏡觀察凋亡細(xì)胞經(jīng)濃度為100 μmol/L二膦酸鹽作用48 h后,用刮刀將其從瓶底刮下,3%戊二醛固定,再用1%鋨酸固定,逐級(jí)酒精脫水,氧化丙烯浸透,樹脂包埋,超薄切片機(jī)切片,透射電子顯微鏡下觀察并攝影。

        2 結(jié)果

        二膦酸鹽對(duì)體外GCT單核基質(zhì)細(xì)胞的影響。

        2.1普通光學(xué)顯微鏡觀察 實(shí)驗(yàn)組Stc經(jīng)一定濃度二膦酸鹽(100 μmol/L)作用一定時(shí)間(48 h)后,細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,貼壁能力下降,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生皺縮、偽足變少、細(xì)胞變圓,失去原有的多邊形特點(diǎn),體積變小,胞質(zhì)密度增高,細(xì)胞核膜保持完整,染色質(zhì)進(jìn)行性固縮等變化。

        2.2透射電鏡觀察 凋亡Stc經(jīng)濃度為100 μmol/L二膦酸鹽作用48 h后,細(xì)胞體積縮小,胞膜完整但發(fā)生皺縮,染色質(zhì)凝聚、固縮、邊聚,部分出現(xiàn)核碎裂,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本完好,胞質(zhì)出芽,凋亡小體形成,見圖1。

        3 討論

        3.1電鏡在凋亡檢測(cè)方法的綜合選取中的優(yōu)勢(shì) 細(xì)胞發(fā)生凋亡是一種主動(dòng)的死亡過程,呈現(xiàn)特有的有別于細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化特點(diǎn)。

        形態(tài)學(xué)是鑒定細(xì)胞凋亡最可靠的方法。凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化有:凋亡早期的胞膜完整性未破壞,表現(xiàn)為膜發(fā)泡,芽生形成膜包裹的凋亡小體,內(nèi)含完整的細(xì)胞器和核碎片。細(xì)胞變圓,失去原有的多邊形特點(diǎn),體積變小,胞質(zhì)密度增高。細(xì)胞核膜保持完整,染色質(zhì)進(jìn)行性固縮,并向核周形成塊狀結(jié)構(gòu)、致密小體,或邊集于核膜內(nèi)側(cè)呈新月體形。壞死則多表現(xiàn)為細(xì)胞的腫脹變圓,早期胞膜破損,形成大小不一的碎片,而核的變化發(fā)生較晚。形態(tài)學(xué)上早期細(xì)胞凋亡明顯不同于細(xì)胞壞死,但最終凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞一樣發(fā)生細(xì)胞膜的損傷。因此凋亡早期,細(xì)胞膜完整性及核固縮現(xiàn)象是判斷細(xì)胞凋亡還是壞死的重要手段,常用的方法有丫啶橙-溴化乙啶雙染及Giemsa染色等方法,而使用高倍率的電鏡則可直接觀察到細(xì)胞核固縮的變化。

        3.2二膦酸鹽誘導(dǎo)Stc凋亡效應(yīng) 二膦酸鹽的抗骨吸收的作用機(jī)制[2]可能為以下三點(diǎn):①直接改變破骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué),使成熟破骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生變化,從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡;②與骨基質(zhì)理化結(jié)合,抑制溶酶體酶以及前列腺素等的合成,導(dǎo)致破骨細(xì)胞功能下降;③直接抑制成骨細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子如IL-6、TNF的產(chǎn)生[3],促使成骨細(xì)胞釋放出可溶性因子,作用于破骨細(xì)胞的前體,防止破骨細(xì)胞的形成,為骨巨細(xì)胞瘤術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的防治探索一條新的途徑。該研究表明二磷酸鹽很可能是一種潛在的有前途的治療GCT的方法。

        本實(shí)驗(yàn)研究中觀察在一定濃度二磷酸鹽(即100 μmol/L)下經(jīng)過48 h誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的GCT細(xì)胞凋亡,透射電鏡觀察凋亡小體及凋亡細(xì)胞細(xì)胞器超微變化:Stc經(jīng)濃度為100 μmol/L二磷酸鹽作用48 h后,細(xì)胞體積縮小,胞膜完整但發(fā)生皺縮,染色質(zhì)凝聚、固縮、邊聚,部分出現(xiàn)核碎裂,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本完好,胞質(zhì)出芽,可見凋亡小體形成,該方法從直觀形態(tài)學(xué)角度提示Stc在體外經(jīng)過一定濃度一定時(shí)間的二磷酸鹽作用后可以發(fā)生細(xì)胞凋亡。

        總之,凋亡檢測(cè)方法很多,實(shí)驗(yàn)過程中很少全部應(yīng)用,而電鏡在凋亡檢測(cè)方法的綜合選取中的優(yōu)勢(shì)在于能為細(xì)胞凋亡研究提供更加直接豐富的圖像信息,可清晰顯示細(xì)胞膜完整性、核固縮現(xiàn)象、凋亡小體形成等,對(duì)觀察凋亡細(xì)胞的細(xì)胞器水平變化有重要意義,因此通過電鏡手段觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化很有必要。

        參考文獻(xiàn):

        [1]Cowan RW,Singh G.Giant cell tumor of bone:a basic science perspective[J].Bone,2013,52(1):238-246.

        [2]Chen G,Deng C,Li YP.TGF-beta and BMP signaling in osteoblast differentiation andbone formation[J].Int J Biol Sci,2012,8(2):272-288.

        [3]Bose S,Roy M,Bandyopadhyay A.Recent advances in bone tissue engineering scaffolds[J].Trends Biotechnol,2012,30(10):546-554.

        編輯/翟辰萬

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