鐘全強(qiáng)，吳洪文，歐夏妙，蒙　杰，唐景財(cái)

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院暨柳州市工人醫(yī)院，柳州 545005；2.廣西桂林市人民醫(yī)院，桂林 541002)

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厄貝沙坦對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用及對(duì)VEGF表達(dá)的影響

鐘全強(qiáng)1，吳洪文2▲，歐夏妙2，蒙杰2，唐景財(cái)2

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院暨柳州市工人醫(yī)院，柳州 545005；2.廣西桂林市人民醫(yī)院，桂林 541002)

【摘要】目的研究厄貝沙坦對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用及對(duì)血管表皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)水平的影響。方法采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)厄貝沙坦對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞分別作用24 h、48 h、72 h后的抑制率，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)厄貝沙坦高、中、低三個(gè)劑量(7.2 μg/ml、3.6 μg/ml、1.8 μg/ml)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞干預(yù)前后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞中VEGF表達(dá)水平的差異，以順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照組(給藥濃度為5 μg/ml)。結(jié)果厄貝沙坦對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC(50))為2.3 μg/ml；厄貝沙坦對(duì)細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，且隨著濃度的增加而增強(qiáng)，三個(gè)劑量組與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；厄貝沙坦作用組中VEGF的表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 厄貝沙坦高劑量組和順鉑陽(yáng)性對(duì)照組VEGF的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論厄貝沙坦對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用，可以下調(diào)血管表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平。

【關(guān)鍵詞】厄貝沙坦；乳腺癌MCF-7細(xì)胞；血管表皮生長(zhǎng)因子；抑制作用

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑厄貝沙坦購(gòu)自浙江華海藥業(yè)股份有限公司；順鉑注射液購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰島素均購(gòu)自杭州四季青生物工程公司：DMEM加1.0 mM丙酮酸鈉，0.1 mM非必需氨基酸和1.5 g/L碳酸氫鈉，添加0.01 mg/ml胰島素和10%胎牛血清。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物科技有限公司；VEGF試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司(2～8℃保存)。

1.1.2試驗(yàn)細(xì)胞乳腺癌MCF-7細(xì)胞株由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提供(試驗(yàn)前，細(xì)胞保存于液氮罐中)。

1.1.3儀器MODEL550酶標(biāo)儀：美國(guó)BIORAD公司；CO2培養(yǎng)箱：美國(guó) thermo forma；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；倒置相差顯微鏡：日本Olympus。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)本次試驗(yàn)所用的MCF-7細(xì)胞株經(jīng)過復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37℃，0.5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化，傳代培養(yǎng)后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行種板，顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整96孔板中細(xì)胞濃度約為5000個(gè)/孔。

1.2.2噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率以空白培養(yǎng)液組作為空白對(duì)照組，分別設(shè)置厄貝沙坦高劑量組、中劑量組、低劑量組三個(gè)組，給藥濃度分別為7.2 μg/ml、3.6 μg/ml、1.8 μg/ml，順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照，給藥濃度為5 μg/ml。MTT法測(cè)定厄貝沙坦對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響：采用MTT法檢測(cè)厄貝沙坦高、中、低三個(gè)劑量組對(duì)乳腺癌細(xì)胞作用24 h、48 h、72 h后的抑制率，運(yùn)用MTT法檢測(cè)厄貝沙坦三個(gè)劑量組干預(yù)后對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)，用酶標(biāo)儀以570 nm/630 nm雙波長(zhǎng)測(cè)定各組細(xì)胞吸光度(A)值，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。重復(fù)上述試驗(yàn)3次，Bliss法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)值，根據(jù)IC50值設(shè)定后續(xù)試驗(yàn)的作用濃度。

1.2.3ELISA法測(cè)定各組中VEGF的表達(dá)采用ELISA法測(cè)定各組中VEGF的表達(dá)，檢測(cè)步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟實(shí)行，在450 nm測(cè)量樣本的吸光度值(A)，測(cè)定的最小值為30 pg/ml，其結(jié)果按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法換算成VEGF的含量(pg/ml)。

2結(jié)果

2.1MTT法的測(cè)定結(jié)果經(jīng)計(jì)算，厄貝沙坦對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的IC50為2.3 μg/ml。在相同作用時(shí)間下(24 h、48 h、72 h)，隨著厄貝沙坦給藥濃度的增加，其對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)(P<0.05或0.01)；在低、中、高三個(gè)劑量組，隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，厄貝沙坦對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用也逐漸增強(qiáng)(P<0.05或0.01)，表現(xiàn)出劑量依賴性及濃度依賴性。見表1、圖1。

2.2ELISA法測(cè)定各組中VEGF的表達(dá)結(jié)果試驗(yàn)分為厄貝沙坦高、中、低三個(gè)劑量組和順鉑陽(yáng)性對(duì)照組(5 μg/ml)，測(cè)定各組藥物作用下細(xì)胞中VEGF的表達(dá)水平，以未給藥物培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組，厄貝沙坦高、中、低三個(gè)劑量組作用24 h、48 h、72 h后，分別與空白對(duì)照組24 h、48 h、72 h VEGF含量對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，厄貝沙坦高劑量組和順鉑陽(yáng)性對(duì)照組VEGF的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1　各組藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.01；與低劑量組比較，bP<0.05，cP<0.01；與中劑量組比較，dP<0.01；同組與厄貝沙坦作用24 h比較，eP<0.05，fP<0.01;同組與厄貝沙坦作用48 h比較，gP<0.01。

圖1 厄貝沙坦高、中、低三個(gè)劑量組對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用

表2　各組藥物作用下細(xì)胞中VEGF表達(dá)水平

注：與空白對(duì)照組比較,aP<0.01。

3討論

本研究結(jié)果表明：厄貝沙坦對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用，隨著藥物作用濃度的提高，以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用呈時(shí)間、濃度依賴性，試驗(yàn)中還測(cè)定了厄貝沙坦對(duì)MCF-7細(xì)胞中VEGF表達(dá)水平的調(diào)控作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著厄貝沙坦給藥濃度的增加，可以顯著下調(diào)腫瘤細(xì)胞中VEGF的含量，厄貝沙坦高、中、低三個(gè)劑量組分別與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)此研究結(jié)果推測(cè)，厄貝沙坦對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用可能與其下調(diào)VEGF因子這一作用機(jī)制相關(guān)。另外，本研究結(jié)果也與國(guó)外相關(guān)的一些報(bào)道相印證，Tanaka N等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腎素血管緊張素在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)中具有重要作用。一些腎素血管緊張素抑制劑，如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEIs)或血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑在臨床應(yīng)用后，可能會(huì)影響惡性腫瘤的進(jìn)展。研究者通過對(duì)279例接受腎輸尿管切除術(shù)的局部上尿路上皮細(xì)胞癌(確診后分期為pTa-3NOMO)的病人，在腎素血管緊張素抑制劑和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑干預(yù)下的預(yù)后數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)未給予RAS抑制劑對(duì)降低隨后的腫瘤無轉(zhuǎn)移生存率是一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Mc Menamin UC等[7]研究了ACEIs和血管緊張素受體阻滯劑(ARBs)對(duì)腫瘤病人的疾病進(jìn)展和生存期的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，使用ACEI/ARB后可以預(yù)防乳腺癌的復(fù)發(fā)和大腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但更可靠的證據(jù)仍需進(jìn)一步研究。Vinson GP等[8]試驗(yàn)研究證明：血管緊張素Ⅱ通過AT1受體發(fā)揮作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成，這些促進(jìn)作用可以通過阻斷血管緊張素Ⅱ而受到抑制。有關(guān)ACE的表達(dá)水平和分布或AT1受體在許多腫瘤疾病的差異表達(dá)的流行病學(xué)證據(jù)直接支持了這一研究結(jié)論，該結(jié)果也為使用高劑量的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和AT1(或AT2)受體阻滯劑在乳腺癌的治療中提供可行性，但這些結(jié)論仍有待進(jìn)一步深入研究，最近的研究主要集中在AT1受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)調(diào)控通路。Napoleone E等[9]研究發(fā)現(xiàn)：RAS可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和血管的生成，ACEIs和血管緊張素Ⅱ-1受體阻滯劑有預(yù)防腫瘤的可能性，組織因子(TF)在腫瘤的進(jìn)展與腫瘤的生長(zhǎng)、血管生成及轉(zhuǎn)移等過程相關(guān)。AT1受體競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑氯沙坦可以降低MDA-MB-231細(xì)胞中TF和血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平，從而對(duì)腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后產(chǎn)生影響。

本試驗(yàn)結(jié)果表明：血管緊張素-Ⅱ受體抑制劑厄貝沙坦可以顯著下調(diào)腫瘤細(xì)胞中VEGF因子的表達(dá)水平，它對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用很可能與這一下調(diào)機(jī)制相關(guān)，由于腫瘤細(xì)胞中血管的生成及腫瘤的形成轉(zhuǎn)移都和VEGF因子相關(guān)[10]，因此VEGF因子可作為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物治療效果的指標(biāo)，而本研究中的厄貝沙坦有望為臨床進(jìn)一步聯(lián)合用藥進(jìn)行抗腫瘤治療提供新的方向。

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(編輯：潘明志)

Influence of Irbesartan on expression of VEGF and its inhibition effect on the proliferation of MCF-7 in breast cancer

ZHONGQuanqiang1,WUHongwen2▲,OUXiamiao2,MENGJie2,TANGJingcai2

(1.TheFourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity—LiuzhouWorker'sHospital,Liuzhou545005; 2.ThePeople’sHospitalofGuilin，Guilin541002,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Irbesartan on expression level of VEGF (vascular epidermal growth factor) and its inhibition effect on the proliferation of MCF-7 in breast cancer. MethodsThe MTT method was used to detect the inhibition rate of irbesartan on the MCF-7 cells after effecting 24 h, 48 h and 72 h, respectively. Enzyme-linked immunoabsorbent assayed(ELISA) was used to detect the level of VEGF in MCF-7 cells influenced by the combination use of irbesartan(the dose of irbesartan were divided into high-dose, middle-dose and low-dose which was 7.2 μg/ml, 3.6 μg/ml and 1.8 μg/ml, respectively). Cis-platinum was taken as positive control group (concentration of drug was 5 μg/ml). Results The 50% inhibition concentration(IC(50))of irbesartan on MCF-7 was 2.3 μg/ml. Irbesartan can inhibit the MCF-7 cancer cells significantly, the inhibiting effect was enhanced while increasing the inhibitor's dosage, difference between the three dosage groups and the blank control group was statistically significant(P<0.05 or 0.01). Difference of expression levels of VEGF between the irbesartan effecting groups and blank control group was statistically significant(P<0.01), but difference between high-dose group and cis-platinum positive control group was not statistically significant(P>0.05).ConclusionIrbesartan can inhibit the proliferation of MCF-7 cancer cells in breast cancer significantly, and lower expression levels of VEGF.

【Key words】irbesartan; MCF-7 cells in breast cancer; VEGF; inhibition effect

(收稿日期：2015-11-04修回日期：2016-02-25)

中圖分類號(hào)：R739.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.01.005

作者簡(jiǎn)介：鐘全強(qiáng)，男，主管藥師，碩士研究生。E-mail:zhongquanqiang@126.com▲通信作者：吳洪文。E-mail:wuhongwen5918@163.com

基金項(xiàng)目：廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科研計(jì)劃課題(Z2014682)

國(guó)內(nèi)外眾多研究表明：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中血管生長(zhǎng)的重要因子之一。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin-angiotensin system，RAS)是體內(nèi)調(diào)節(jié)水鈉潴留的重要系統(tǒng)，是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)。最近的研究表明：腎素血管緊張素在多種腫瘤疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用，血管緊張素與腫瘤疾病的進(jìn)展具有高度相關(guān)性[1～3]。許多腫瘤細(xì)胞組織中VEGF高表達(dá)，癌細(xì)胞能自身合成VEGF；而RAS與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)[4，5]。本文探討血管緊張素Ⅱ受體抑制劑厄貝沙坦對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用和對(duì)VEGF因子表達(dá)的影響，為臨床抗腫瘤靶向治療提供理論參考。