黃　琴，黃炳臣，陳家興，黃　芳，黃照權(quán)，謝　亮，龍艷丹，羅春英

(右江民族醫(yī)學(xué)院1.2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)本科，2.臨床醫(yī)學(xué)院，3.2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)本科，

4.廣西高校桂西地區(qū)高發(fā)病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，百色 533000)

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E-選擇素在大腸癌組織腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床病理意義

黃琴1，黃炳臣2，陳家興3，黃芳3，黃照權(quán)2，謝亮3，龍艷丹3，羅春英4▲

(右江民族醫(yī)學(xué)院1.2011級(jí)臨床醫(yī)學(xué)本科，2.臨床醫(yī)學(xué)院，3.2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)本科，

4.廣西高校桂西地區(qū)高發(fā)病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，百色 533000)

【摘要】目的探討E-選擇素蛋白在大腸癌組織腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床病理意義。方法運(yùn)用免疫組織化學(xué)法，采用E-選擇素抗體檢測116例大腸癌組織和57例癌旁正常腸黏膜組織E-選擇素的表達(dá)情況，分析比較E-選擇素在大腸癌腫瘤細(xì)胞和正常腸黏膜中的表達(dá)差異及其臨床病理意義。結(jié)果E-選擇素在大腸癌腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)，其在腫瘤細(xì)胞中陽性表達(dá)率(38.8%，45/116)明顯高于癌旁正常腸黏膜腺體組織上皮細(xì)胞E-選擇素的陽性表達(dá)率(5.3%，3/57)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.4335，P<0.001)。但腫瘤細(xì)胞E-選擇素陽性率在不同腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(40.3% vs 37.0%、37.0% vs 42.9%、31.4% vs 44.6%、32.7% vs 43.8%，P均>0.05)。結(jié)論大腸癌組織腫瘤細(xì)胞表達(dá)E-選擇素，但腫瘤細(xì)胞的這一分子特征在不同生物學(xué)行為的大腸癌病例間無顯著差異。

【關(guān)鍵詞】E-選擇素；大腸癌；免疫組織化學(xué)

近十年來，我國大腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，E-選擇素是黏附分子受體，能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，從而影響腫瘤的生物學(xué)行為，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用[2]。也有文獻(xiàn)報(bào)道E-選擇素在結(jié)直腸癌腫瘤患者血清中檢測水平較高，與該腫瘤的惡性生物學(xué)行為及預(yù)后關(guān)系密切[3]。為探討E-選擇素在大腸癌腫瘤組織中的表達(dá)情況及其臨床意義，我們采用免疫組織化學(xué)法檢測116例大腸癌組織和57例癌旁正常腸黏膜組織E-選擇素蛋白的表達(dá)情況，分析E-選擇素在大腸癌組織中癌細(xì)胞的表達(dá)情況及其臨床病理意義。

1材料與方法

1.1材料選取右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2011年1月～2012年1月間，病理確診為大腸癌的手術(shù)切除標(biāo)本116例和癌旁正常腸黏膜組織57例，所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋。所有病例術(shù)前均未接受放、化療或免疫治療，116例病例中男89例，女27例，年齡22～92歲，平均(56.7±4.9)歲；≥60歲58例，<60歲58例；腫瘤直徑<5 cm的62例，≥5 cm的54例；高分化腺癌81例，中-低分化腺癌35例；腫瘤浸潤肌層51例，浸潤至漿膜層65例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 64例。

1.2試劑及方法E-選擇素單克隆抗體購于R&D Systems公司，二抗、DAB 染色劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用免疫組化En Vision兩步法檢測，其主要操作步驟：(1)石蠟切片，脫蠟至水。(2)抗原修復(fù)，采用枸櫞酸緩沖液高壓抗原修復(fù)，高壓鍋噴氣2 min，放置冷卻至室溫。(3)3%H2O2室溫孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性。(4)切片滴加非免疫牛血清室溫下存放10 min，以封閉非特異性抗原反應(yīng)。(5)滴加 25 mg/L鼠抗人E-選擇素單克隆抗體，4 ℃下孵育過夜，然后用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min。(6)每張切片滴加二抗多聚復(fù)合物，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min。(7)DAB顯色、蘇木素復(fù)染及中性樹脂封片。用已知陽性切片作陽性對(duì)照，以0.1 mol/L PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判斷光鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，在細(xì)胞胞漿、胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒，且染色明顯高于背景，判讀為陽性。根據(jù)病變區(qū)域陽性細(xì)胞所占百分比記分：隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)26%～50%記為1分，51%～75%記為2分，>75%記為3分。根據(jù)病變區(qū)域的普通染色強(qiáng)度記分:1分：無著色或淡黃色；2分：棕黃色；3分：明顯著色為棕褐色。綜合細(xì)胞著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)判定陽性強(qiáng)度和陽性率，取兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為最終綜合評(píng)分，評(píng)分1～3分判定為陰性表達(dá)， 4～9分判定為陽性表達(dá)[4]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩樣本間率的比較采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，相關(guān)分析采用列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2結(jié)果

2.1E-選擇素在大腸癌組織和癌旁正常腸黏膜組織的表達(dá)E-選擇素陽性信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒，其在腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)(圖1A、B)。E-選擇素在腫瘤細(xì)胞中陽性表達(dá)率(38.8%，45/116)明顯高于癌旁正常腸黏膜腺體中的陽性表達(dá)率(5.3%，3/57)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.4335，P<0.001)。

2.2大腸癌組織中腫瘤細(xì)胞E-選擇素蛋白表達(dá)及其與大腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系應(yīng)用單因素χ2檢驗(yàn)分析，腫瘤細(xì)胞E-選擇素陽性率在不同腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且E-選擇素表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05)。見表1。

A:在中分化腺癌組織中腫瘤和血管呈陽性;B:在腺癌組織腫瘤細(xì)胞中呈陽性。 圖1 E-選擇素在大腸癌組織中的陽性表達(dá)(EnVision兩步法:×200)

表1　E-選擇素在大腸癌組織中腫瘤細(xì)胞的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系(n,%)

3討論

E-選擇素是黏附分子選擇素家族成員之一，在炎癥反應(yīng)、血液凝固、免疫、識(shí)別、腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要的作用[4]。靜息狀態(tài)下E-選擇素僅在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)且含量甚微。內(nèi)皮細(xì)胞受炎性因子、IL-1、腫瘤壞死因子、細(xì)菌脂多糖等刺激后，E-選擇素作為誘導(dǎo)性黏附分子與其配體結(jié)合后介導(dǎo)細(xì)胞黏附和組織特異性招募，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)展和腫瘤的轉(zhuǎn)移[5～7]。Ye CL等[4]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶鄰近的小血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)E-選擇素，為癌細(xì)胞分泌的刺激因子所誘導(dǎo)，表達(dá)程度與血管和癌灶的距離呈負(fù)相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)E-選擇素的表達(dá)在轉(zhuǎn)移灶強(qiáng)于原發(fā)灶。一般認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞激活內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的E-選擇素能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面選擇素配體并與之結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的識(shí)別和黏附，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Liu FR等[8]發(fā)現(xiàn)西咪替丁可以通過抑制E-選擇素受體sLe-X，阻礙胃癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。Min TJ等[9]研究發(fā)現(xiàn)嗎啡緩釋劑和LPS合用可以稀釋血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的E-選擇素，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌組織中，E-選擇素不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，而且在腫瘤細(xì)胞也有表達(dá)，陽性表達(dá)率為38.8%(45/116)，高于癌旁正常腸黏膜組織腺上皮細(xì)胞E-選擇素的陽性表達(dá)率(5.3%，3/57)，兩者差異顯著。提示大腸癌組織中腫瘤細(xì)胞表達(dá)E-選擇素是不可忽視的分子特征。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)E-選擇素在不同患者的年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度和有無淋巴道轉(zhuǎn)移病例間的差異無顯著性。張勇超[10]研究報(bào)道血清可溶性E-選擇素水平與腫瘤部位及組織學(xué)分型也無明顯相關(guān)。而安萍等人[11]檢測結(jié)直腸癌患者可溶性E-選擇素血清水平，發(fā)現(xiàn)E-選擇素檢測的特異性和敏感性高于CA19-9、CEA、CA724等傳統(tǒng)的消化道腫瘤標(biāo)志物。張梁等人[3]報(bào)道隨著臨床分期的上升，E-選擇素水平顯著升高，其水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分期呈正相關(guān)。關(guān)于大腸癌組織中癌細(xì)胞表達(dá)的E-選擇素確切的臨床病理意義有待進(jìn)一步探索研究。

綜上所述，E-選擇素是一種表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞表面的細(xì)胞黏附分子，但在大腸癌組織腫瘤細(xì)胞中有較明顯的表達(dá)，其表達(dá)在不同患者年齡、性別、腫瘤直徑大小、分化程度、浸潤深度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例間差異無顯著性。關(guān)于腫瘤組織中癌細(xì)胞表達(dá)的E-選擇素對(duì)腫瘤和機(jī)體的影響、意義和作用機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和探討，為預(yù)測大腸癌腫瘤的生物學(xué)行為和防治提供新思路和方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳瓊，劉志才，程蘭平，等. 2003～2007年中國結(jié)直腸癌發(fā)病與死亡分析[J].中國腫瘤，2012，21(3): 179-182.

[2] 周萍，成玉霞， 張貴慧，等. E-選擇素及其配體SLeX介導(dǎo)大腸癌早期黏附的觀察[J]．中華腫瘤防治雜志，2010，17(16):1273-1276，1279．

[3] 張梁，黃涵，周娜，等.結(jié)直腸癌患者血清可溶性 E-選擇素及細(xì)胞黏附分子-1水平及臨床意義[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2010, 25(8):606-608.

[4] Ye CL, Kiriyama K, Mistuoka C, et al. Expression of E-selectin on endothelial cells of small veins in human colorectal cancer[J].Int J Cancer,1995,61(4):455-460.

[5] 蔡慧云，趙菲，安萍.胃癌患者血清可溶性 E選擇素的表達(dá)及臨床意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(4):588-590.

[6] 王慶，張長樂．E-選擇素與消化道腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J/CD]．中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2012，6(24):8270-8272．

[7] 史梅英，趙志英.E-選擇素與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2011，43(8):945-947.

[8] Liu FR，Jiang CG，Li YS，et al．Cimetidine inhibits the adhesion of gastric cancer cells expressing high levels of sialyl Lewis x in human vascular endothelial cells by blocking E-selectin expression[J]. Int J Mol Med,2011,27(4):537-544．

[9] Min TJ, Park SH, Ji YH, et al．Morphine attenuates endothelial cell adhesion molecules induced by the supernatant of LPS-stimulated colon cancer cells[J].J Korean Med,2011,26(6):747-752．

[10] 張勇超.胃癌患者血清可溶性E-選擇素檢測的臨床意義[J].中國腫瘤臨床，2010，37(7): 402-404.

[11] 安萍，蔡惠蕓，齊洪峰，等.結(jié)直腸癌患者血清可溶性E選擇素表達(dá)及臨床意義的研究[J].華北國防醫(yī)藥，2008，20(3):12-14.

(編輯：潘明志)

Expression of E-selectin protein in tumor cells of the colorectal cancer tissue and its clinical pathological significance

HUANGQin1,HUANGBingchen1,CHENJiaxing1,HUANGFang1,HUANGZhaoquan1,XIELiang1,LONGYandan1,LUOChunying2▲

(1.UndergraduatesofClinicalMedicineinGrade2011, 2.ClinicalMedicineCollege, 3.UndergraduatesofClinicalMedicineinGrade2012,YoujiangMedicalUniversityforNationalities;4.KeyLaboratoryofControlandPreventionofHighIncidenceofDiseaseinWesternGuangxiamongGuangxiUniversities,Baise533000,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of E-selectin protein in tumor cells of the colorectal cancer tissue and its clinical pathological significance. MethodsThe protein expressions of the E-selectin in 116 cases of colorectal cancer tissues and 57 cases of normal intestinal mucosa tissue adjacent to carcinoma were detected by immunohistochemistry. Meanwhile, differences of expression and clinical pathological significance of E-selectin in tumor cells of the colorectal cancer tissue and normal intestinal mucosa were analyzed and compared. Results The protein of the E-selectin expressed not only in vascular endothelial cells but also in colorectal cancer cells. The positive expression rates of E-selectin(38.8%, 45/116) in colorectal cancer cells was apparently higher than that(5.3%，3/57)in normal mucosa adjacent to carcinoma, so difference was statistically significant (χ2=21.4335,P<0.001). However, differences of E-selectin in intestinal colorectal cancer cells and different tumor diameter, differentiation degree, infiltration depth and with or without lymph node metastasis was not statistically significant(40.3% vs 37.0%, 37.0% vs 42.9%, 31.4% vs 44.6% and 32.7% vs 43.8%, P all >0.05).ConclusionTumor cells of colorectal cancer can express E-selectin, but this molecular characteristic is not significantly different among different colorectal cancer cases with different biological behavior.

【Key words】E-selectin; colorectal cancer; immunohistochemistry

(收稿日期：2016-01-06修回日期：2016-02-26)

中圖分類號(hào)：R735.3+4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.01.002

作者簡介：黃琴，女，本科在讀。E-mail：969554744@qq.com▲通信作者：羅春英。E-mail:chun2005008@163.com

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFBA053121)；廣西壯族自治區(qū)級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃立項(xiàng)項(xiàng)目(201410599017)；廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(gxzdsysyy2015204)