王月娥,王春玉(肥城礦業(yè)中心醫(yī)院，山東泰安7608；中國(guó)醫(yī)科大學(xué))

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FOXA1對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制探討

王月娥1,王春玉2(1肥城礦業(yè)中心醫(yī)院，山東泰安271608；2中國(guó)醫(yī)科大學(xué))

摘要：目的觀察叉頭框蛋白A1(FOXA1)對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌TPC1細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，并探討其機(jī)制。方法培養(yǎng)TPC1細(xì)胞，分為兩組，分別轉(zhuǎn)染Flag-vector(空載體組)及Flag-FOXA1(FOXA1組)。轉(zhuǎn)染12、24、36 h時(shí)，采用MTT法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖活性。轉(zhuǎn)染24 h后，采用流式單染細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，采用Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白27(p27 Kip1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1) mRNA的表達(dá)，采用Western blot法檢測(cè)p27 Kip1、CDK2、Cyclin D1 蛋白的表達(dá)。結(jié)果與空載體組比較，F(xiàn)OXA1組細(xì)胞增殖率增加,G1期細(xì)胞比例減少，而S期細(xì)胞比例增加(P均<0.05)。與空載體組比較，F(xiàn)OXA1組p27 Kip1 mRNA及蛋白表達(dá)降低，CDK2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)增加(P均<0.05)。結(jié)論FOXA1可促進(jìn)TPC1細(xì)胞增殖，使S期細(xì)胞增加，其機(jī)制可能與下調(diào)p27 Kip1及上調(diào)CDK2、CyclinD1表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：叉頭框蛋白A1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；甲狀腺癌

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。其中以乳頭狀甲狀腺癌最常見(jiàn)，預(yù)后較好[2]。乳頭狀甲狀腺癌的病因目前尚不清楚，研究與乳頭狀甲狀腺癌發(fā)病有關(guān)的基因具有重要意義。叉頭框蛋白(FOXA)家族是肝臟特異性轉(zhuǎn)錄因子家族[3]，包括FOXA1、FOXA2、FOXA3[4]。其中，F(xiàn)OXA1參與上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化[5]以及肝、肺、前列腺、胰腺的發(fā)育[6]，對(duì)乳腺導(dǎo)管形成至關(guān)重要[7]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA1參與調(diào)節(jié)肺癌、腦腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌的發(fā)生過(guò)程[4]。FOXA1被認(rèn)為是核激素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵因子[8],但FOXA1在乳頭狀甲狀腺癌發(fā)病中的作用尚不明確。2014年4月，我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將FOXA1轉(zhuǎn)染人乳頭狀甲狀腺癌TPC1細(xì)胞，觀察對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，并探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及試劑TPC1細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)自寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自普洛麥格生物有限公司；Protein marker、Lipofectimine2000、高糖DMEM、胎牛血清、ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；Flag抗體購(gòu)自上海睿星生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞周期調(diào)控蛋白27(p27 Kip1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)購(gòu)自Cell Signaling公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司；引物合成、DNA測(cè)序由北京華大基因公司完成。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)。用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)TPC1細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，將TPC1細(xì)胞鋪于6孔板。待細(xì)胞融合達(dá)到80%時(shí)，按照Lipofectimine2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)，將Flag-vector(空載體組)及Flag-FOXA1(FOXA1組)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到TPC1細(xì)胞中。24 h后收集兩組細(xì)胞，提取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白免疫印記檢測(cè)示FOXA1蛋白表達(dá)，表明FOXA1組Flag-FOXA1真核表達(dá)質(zhì)粒在TPC1細(xì)胞中表達(dá)，F(xiàn)OXA1轉(zhuǎn)染成功。

1.3細(xì)胞增殖活性檢測(cè)采用MTT法。轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM重懸，按4×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，分別培養(yǎng)12、24、36 h后，每孔加MTT液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加DMSO 200 μL，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔的吸光度值(OD值)。增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.4細(xì)胞周期檢測(cè)采用流式單染細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染24 h后，用0.25%胰蛋白酶將兩組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化，離心5 min，預(yù)冷PBS清洗1遍，加入預(yù)冷70%乙醇，4 ℃固定過(guò)夜，離心收集細(xì)胞，加入500 μL含50 μg/mL溴化乙錠(PI)的PBS(含有100 μg/mL RNase A和0.1% Triton X-100)，室溫避光作用30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞周期。

1.5細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)采用Real-time PCR法。轉(zhuǎn)染24 h后，提取細(xì)胞總RNA。取1 μg樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用Primer Premier 5設(shè)計(jì)，F(xiàn)OXA1上游5′-GCAATACTCGCCTTACGGCT-3′，下游5′-GTGTTTAGGACGGGTCTGGA-3′；p27上游5′-TGCAACCGACGATTCTTCTAC-3′，下游5′-TCCT-TGCTTCATCAAGCAGTG-3′；CDK2上游5′-TGTGGC-GCTTAAGAAAATCC-3′，下游5′-CCAGCAGCTTGAC-GATGTTA-3′；Cyclin D1上游5′-GGATGCTGGAGGT-CTGCGA-3′，下游5′-AGAGGCCACGAACATGCAA-3′；GAPDH上游5′-ACTCCACTCACGGCAAATTC-3′，下游5′-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3′。PCR反應(yīng)液為20 μL，反應(yīng)液配置在冰上進(jìn)行，反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，檢測(cè)p27 Kip1、CDK2、Cyclin D1 mRNA的表達(dá)。

1.6細(xì)胞周期相關(guān)蛋白檢測(cè)采用Western blot法。在空載體組、FOXA1組中分別加入100 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上放置，收集所有液體；超聲破碎儀破碎細(xì)胞2次，離心30 min后，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，G250考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行蛋白定量。取40 μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離，4 ℃ 40 V恒壓將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。使用Flag標(biāo)簽抗體、GAPDH、p27、CDK2、Cyclin D1作為一抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠/兔(1∶5 000)稀釋二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，進(jìn)行ECL顯影。GAPDH作為內(nèi)參，檢測(cè)p27、CDK2、 CyclinD1蛋白表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組細(xì)胞增殖率比較空載體組12、24、36 h時(shí)增殖率分別為43.7%、51.2%、65.2%，F(xiàn)OXA1組分別為47.6%、75.4%、95.6%，F(xiàn)OXA1組24、36 h時(shí)的增殖率均高于空載體組(P均<0.05)。

2.2兩組細(xì)胞周期結(jié)果空載體組G1、S期細(xì)胞比例分別占80.74%、13.93%，F(xiàn)OXA1組分別為71.47%、20.02%，F(xiàn)OXA1組G1期細(xì)胞減少，而S期細(xì)胞比例增加(P均<0.05)。

2.3兩組細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)空載體組各細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)均為1，F(xiàn)OXA1組p27、CDK2、 Cyclin D1 mRNA分別為0.524、1.584、1.825，F(xiàn)OXA1組p27 Kip1 mRNA表達(dá)降低，CDK2、Cyclin D1 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。

2.4兩組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)FOXA1組p27 Kip1蛋白表達(dá)降低，CDK2、Cyclin D1表達(dá)增加。見(jiàn)圖1。

注：1為空載體組，2為FOXA1組。

圖1兩組p27 Kip1、CDK2、Cyclin D1蛋白表達(dá)

情況(Western blot法)

3討論

FOX家族有17個(gè)亞家族，總成員超過(guò)100個(gè)，廣泛參與胚胎形成、細(xì)胞生長(zhǎng)分化、發(fā)育、代謝、免疫、細(xì)胞周期調(diào)控等多種生物學(xué)過(guò)程[9,10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OX家族與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系較密切，其中FOXA1與腫瘤的關(guān)系最密切。

FOXA1基因位于人染色體14q21.1位點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)包括N端的轉(zhuǎn)錄激活域、中間與DNA結(jié)合的FOX域以及C端與組蛋白h1/H4相關(guān)的激活轉(zhuǎn)錄結(jié)合域[11]。FOXA1可通過(guò)取代組蛋白H1及二甲基化h1賴氨酸4和DNA基因組去甲基化，從而松解與之相結(jié)合的致密染色質(zhì)區(qū)域并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，因此被稱為先鋒因子[12]。FOXA1在乳腺、食管、肝臟、胰腺、膀胱、前列腺、結(jié)腸和肺組織中均有表達(dá)[13]，參與代謝過(guò)程、信號(hào)調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期相關(guān)基因的啟動(dòng)，并且與肺癌、食管癌、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[12]。

細(xì)胞周期作為基本的生物學(xué)功能之一，分為間期與分裂期，間期又分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)，M期為細(xì)胞分裂期。其G1/S、S期及G2/M期檢查點(diǎn)影響著細(xì)胞周期進(jìn)程、增殖及細(xì)胞化療敏感性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA1促進(jìn)人乳頭狀甲狀腺癌TPC1細(xì)胞增殖活性，與空載體組比較，F(xiàn)OXA1組G1期細(xì)胞減少，而S期細(xì)胞增加，提示FOXA1能夠加速TPC1細(xì)胞周期進(jìn)展，使G1期細(xì)胞減少、S期細(xì)胞增多，因此FOXA1對(duì)細(xì)胞進(jìn)程有影響。

p27基因是調(diào)控細(xì)胞周期并抑制細(xì)胞分裂的重要基因，其定位于12p13，其編碼的蛋白質(zhì)含有198個(gè)氨基酸，分子量約為27 kD。p27基因是細(xì)胞周期抑制子，在癌細(xì)胞中能夠促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡、抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化，而在良性腫瘤和惡性腫瘤中p27蛋白表達(dá)降低。Gardner 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，p27 可通過(guò)抑制CDK2的活性，從而阻滯細(xì)胞周期。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)是一類關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白酶，該酶的活化與鈍化維持著細(xì)胞周期各時(shí)相有序進(jìn)行。CDK2是完成G1期和進(jìn)入S期一個(gè)非常關(guān)鍵的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中多個(gè)信號(hào)通路的整合[1]。Cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)增高與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA1組p27 Kip1 mRNA及蛋白表達(dá)降低，CDK2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)增加，提示p27 Kip1、CDK2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)變化與FOXA1促進(jìn)細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞周期相關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)OXA1可提高人乳頭狀甲狀腺癌TPC1細(xì)胞增殖活性，使S期細(xì)胞增加，其機(jī)制可能與下調(diào)p27 Kip1及上調(diào)CDK2、Cyclin D1表達(dá)有關(guān)。

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Effects of FOXA1 on proliferation and cell cycle of human papillary thyroid carcinoma cells

WangYuee1,WangChunyu

(1FeichengMiningGroupCentralHospital,Taian271608,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of forkhead box protein A1 (FOXA1) on the proliferation and cell cycle of human papillary thyroid carcinoma TPC1 cells and to investigate its mechanism. MethodsTPC1 cells were divided into two groups which were separately transfected with Flag-vector (empty vector group) and Flag-FOXA1 (FOXA1 group). The proliferation activity of the two groups of TPC1 cells was detected by MTT method after transfection for 12 h, 24 h and 36 h, and cell cycle was detected by flow cytometry at 24 h. The mRNA and protein expression of p27 Kip1, cyclin-dependent kinase (CDK2) and CyclinD1 was detected by real-time PCR and Western blotting at 24 h after transfection of Flag-FOXA1. ResultsIn the FOXA1 group, the cell proliferation was promoted, cells in the G1 phase decreased, but cells in the S phase increased. Compared with the empty vector group, the expression of p27 Kip1 mRNA and protein was decreased and the expression of CyclinD1 and CDK2 mRNA and protein was increased. Conclusions FOXA1 can promote the cell proliferation and increase the cells in the S period. The mechanism may be related to the down-regulation of p27 Kip1 and up-regulation of CDK2 and CyclinD1 expression.

Key words:forkhead box protein A1; cell proliferation; cell cycle; thyroid carcinoma

(收稿日期：2015-11-04)

中圖分類號(hào)：R736.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)14-0011-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.004

第一作者簡(jiǎn)介：王月娥(1978-)，女，主治醫(yī)師，學(xué)士，主要研究方向?yàn)榧谞钕倌[瘤發(fā)病機(jī)制與治療。E-mail: wangyuee1978@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31401115)。