戴小芳，劉　飛，侯志華，吳　夢(mèng)，陳茂彬，鎮(zhèn)　達(dá)（湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，生物工程學(xué)院，湖北武漢430068）

?

桔酒降酸細(xì)菌的篩選及特性研究

戴小芳，劉飛，侯志華，吳夢(mèng)，陳茂彬，鎮(zhèn)達(dá)
（湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，生物工程學(xué)院，湖北武漢430068）

摘要：為利用生物方法降低桔酒酸度，采用檸檬酸為碳源從各種來(lái)源分離有應(yīng)用潛力的細(xì)菌菌株。通過(guò)桔酒降酸實(shí)驗(yàn)從14株初篩細(xì)菌中復(fù)篩得到1株優(yōu)良菌株LF7，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum。在完成桔酒乙醇發(fā)酵后，加入一定量LF7菌體并控制溫度、氧氣條件、糖度、酒精度及LF7接種量，這5種因素對(duì)降酸效果均有一定影響。降酸溫度20℃、初始糖度16 g/L、酒精度5 %vol條件下發(fā)酵6 d，總酸含量可降低29.7 %。紙層析分析顯示原酒中的檸檬酸完全被利用分解。

關(guān)鍵詞：降酸細(xì)菌；桔酒；總酸；檸檬酸；果酒

不同柑橘果汁的酸度含量可達(dá)到5～16 g/L（以檸檬酸計(jì)），折合為酒石酸為5.8～18.8 g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出國(guó)標(biāo)GB 15037—2006《葡萄酒》中規(guī)定的滴定酸5.0～8.0 g/L（以酒石酸計(jì)）范圍[1-3]。果酒中過(guò)高的有機(jī)酸會(huì)造成酒味過(guò)酸，酒體粗糙以致難以入口。桔酒中存在的有機(jī)酸主要為檸檬酸。有關(guān)果酒中檸檬酸降解的文獻(xiàn)不多。趙玉平等[4]篩選到對(duì)山楂酒檸檬酸降解酵母，王立芳等[5]篩選到可同時(shí)降解蘋(píng)果酸和檸檬酸的酵母。文獻(xiàn)報(bào)道葡萄酒二次發(fā)酵中乳酸菌也可代謝檸檬酸，但是還沒(méi)有針對(duì)柑橘酒檸檬酸降酸乳酸菌的相關(guān)報(bào)道。本研究采用以檸檬酸為碳源的MRS改良培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，從初篩的菌株中復(fù)篩獲得1株疑似乳酸菌的細(xì)菌，該菌株在桔酒降酸中作用效果明顯。實(shí)驗(yàn)對(duì)影響該菌降酸性能的條件及果酒有機(jī)酸成分變化進(jìn)行了分析。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

材料：桔酒原酒（采用10月份湖北本地桔子經(jīng)過(guò)25℃下發(fā)酵6 d獲得。酸度以檸檬酸計(jì)為8.1 g/L、糖度16.0 g/L、酒精度5 %vol、總SO240 mg/L）；14株初篩菌株（利用以檸檬酸為主要碳源的MRS培養(yǎng)基從自然降酸果酒、酸奶、活菌飲料、泡菜汁、香蕉提子皮以及蔬菜葉中分離純化得到）；市售白砂糖用于調(diào)整糖度。

試劑：L-蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、甲酸、正丁醇等，均為國(guó)藥集團(tuán)分析純?cè)噭?/p>

儀器：立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安）；無(wú)菌操作臺(tái)（上海智城）；分析天平、pH計(jì)（梅特勒-托利多）；移液槍?zhuān)ū本┤A美）；恒溫培養(yǎng)箱（寧波萊?？萍迹?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1復(fù)篩

14株初篩菌菌體適量接入桔子酒原酒中密封，在20℃恒溫培養(yǎng)箱中后發(fā)酵7 d左右。取上層酒液，測(cè)定總酸、檸檬酸殘留量，對(duì)菌株進(jìn)行簡(jiǎn)單染色后鏡檢。

1.2.2發(fā)酵條件對(duì)降酸效果影響實(shí)驗(yàn)

選取的可變因素為糖度、接種量、酒精度、溫度及容器充滿(mǎn)系數(shù)（氧氣條件）。使用100 mL已滅菌的試管，雙層保鮮膜密閉封口。除可變因素外都采取糖度16 g/L、酒精度5 %vol、接種量1×105cfu/mL、容器充滿(mǎn)系數(shù)60 %、20℃下發(fā)酵6 d。降酸處理后的桔酒經(jīng)15℃放置6 d（陳釀）后過(guò)濾，進(jìn)行酸度、紙層析分析及感官品評(píng)。發(fā)酵條件的設(shè)置如下：（1）糖度，在原酒殘?zhí)腔A(chǔ)上補(bǔ)加蔗糖，將原酒糖度調(diào)整為16 g/L、26 g/L、36 g/L、46 g/L、56 g/L；(2)接種量，從LF7斜面用原酒制備成菌懸液，分別取適量至原酒中，形成0.5×105～2.5×105cfu/mL共5個(gè)梯度；（3）酒精度，在原酒的酒精度基礎(chǔ)上補(bǔ)加無(wú)水酒精，形成5 %vol～13 %vol的5個(gè)酒精度梯度；（4）發(fā)酵溫度，設(shè)置10～30℃5個(gè)溫度梯度；（5）容器充滿(mǎn)系數(shù)，以容器裝滿(mǎn)為100 %，設(shè)定20 %～100 %共5個(gè)梯度。

1.2.3分析方法

糖度：果酒的殘?zhí)菧y(cè)定采用斐林試劑法；酸度：酸堿滴定法，以檸檬酸計(jì)；酒精度：酒精計(jì)法，蒸餾后測(cè)定；pH值：pH計(jì)法。

有機(jī)酸紙層析分析：展開(kāi)劑為正丁醇∶甲酸∶水（80∶15∶5），標(biāo)準(zhǔn)品濃度（質(zhì)量體積比）琥珀酸0.6 %、蘋(píng)果酸0.4 %、檸檬酸0.28 %、乳酸0.8 %。樣品及標(biāo)準(zhǔn)品均點(diǎn)樣10μL，展開(kāi)2 h左右，揮干溶劑后用溴甲酚紫乙醇溶液顯色。

2　結(jié)果與分析

2.1不同條件對(duì)LF7菌株的降酸效果的影響

從多種來(lái)源分離純化細(xì)菌，將這些初篩菌株接入原酒（見(jiàn)材料1.1）進(jìn)行降酸處理，獲得1株具有明顯效果的菌株，命名為L(zhǎng)F7。LF7分離于自然降酸桔酒中，在MRS培養(yǎng)基上顯示直徑約1 mm的乳白色菌落，鏡檢為桿狀細(xì)菌，革蘭氏染色陽(yáng)性，27F及1492R引物擴(kuò)增16S rDNA序列，產(chǎn)物1.5 kb左右。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，在NCBI進(jìn)行Microbial Nucleotide BLAST，顯示與Lactobacillus plantarum WCFS1（NC_004567）等的16SrDNA序列一致性達(dá)到99 %，可以初步判斷屬于植物乳桿菌。LF7在MRS斜面上活化后制備菌懸液用于接種。

2.1.1酒樣糖度對(duì)降酸效果的影響

在原酒中補(bǔ)加蔗糖以考察含糖量對(duì)LF7菌株降酸效果的影響。由圖1可知，隨著原酒中糖量的增加，酒樣酸度也逐步提高?？赡苁窃频奶欠直籐F7菌體或者雜菌利用產(chǎn)酸。本實(shí)驗(yàn)中的后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再添加蔗糖，原酒糖度保持16 g/L。

圖1 原酒糖度對(duì)LF7菌株降酸的影響

2.1.2 LF7接種量對(duì)降酸效果的影響

實(shí)驗(yàn)中酒樣中加入的LF7菌體濃度為0.5×105～2.5× 105cfu/mL。降酸處理后檢測(cè)酒樣酸度，結(jié)果見(jiàn)圖2，在整體趨勢(shì)上，接種量越大，酒樣酸度越低，說(shuō)明增加接種量有助于降酸效果的提高。

圖2 LF7菌株接種量對(duì)桔酒降酸的影響

2.1.3不同酒精度對(duì)LF7降酸效果的影響

酒精度實(shí)驗(yàn)在原酒5 %vol酒精度的基礎(chǔ)上添加無(wú)水乙醇至理論酒精度為5 %vol、7 %vol、9 %vol、11 %vol、13 %vol，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著酒精度的提高，降酸效果整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在13 %時(shí)下降明顯，說(shuō)明酒精度過(guò)高，不利于LF7的降酸作用。

圖3 原酒酒精度對(duì)LF7降酸效果的影響

2.1.4不同處理溫度對(duì)LF7降酸效果的影響

考慮到過(guò)高的溫度對(duì)果酒質(zhì)量的影響，實(shí)驗(yàn)溫度選擇10℃、15℃、20℃、25℃、30℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，隨著溫度的上升，酸度顯著下降，說(shuō)明LF7菌體活性增加，提高了降酸效果。20℃時(shí)降酸效果已經(jīng)比較理想，適于果酒的降酸處理。

圖4 降酸溫度對(duì)LF7降酸效果的影響

2.1.5氧氣條件對(duì)LF7降酸效果的影響

采用容器充滿(mǎn)系數(shù)設(shè)定不同的氧氣條件。容器充滿(mǎn)系數(shù)設(shè)定為20 %～100 %。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5，系數(shù)越低，酒的酸度越低，說(shuō)明較好的氧氣條件有利于LF7的降酸作用。在給與更多氧氣時(shí)，降酸效果可能更好?？紤]到充分利用容器及氧氣對(duì)果酒品質(zhì)的影響，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)可采用容器適當(dāng)密封的方法控制氧氣的暴露程度。

圖5 氧氣條件對(duì)LF7降酸效果的影響

2.2降酸果酒樣品的紙層析分析

通過(guò)紙層析，比較果汁、原酒及降酸果酒樣品中的主要有機(jī)酸成分及其變化。降酸果酒樣品的制備條件為：原酒酒精度5 %vol，糖度16 g/L，降酸溫度20℃，降酸處理6 d?？偹釡y(cè)定結(jié)果顯示，較未加LF7的對(duì)照樣，處理樣品總酸降低約30 %。由圖6可知，標(biāo)準(zhǔn)品中，琥珀酸與乳酸Rf值相近，難以區(qū)分，其他3種標(biāo)準(zhǔn)品容易辨別。桔汁的有機(jī)酸以檸檬酸為主，含較少的琥珀酸，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]；原酒中以檸檬酸為主，琥珀酸或乳酸含量較果汁有所下降。而所有果汁及果酒樣品中基本上未出現(xiàn)蘋(píng)果酸，而且在點(diǎn)樣起點(diǎn)不遠(yuǎn)處有少量其他有機(jī)酸成分，這可能與該桔子品種有關(guān)[7]。以原酒為原料降酸后，檸檬酸已經(jīng)基本消失，而琥珀酸/乳酸含量增加較明顯。因?yàn)殓晁岷苌僮鳛榘l(fā)酵產(chǎn)物積累，推測(cè)降酸后增加的部分應(yīng)該是乳酸。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄酒的蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵中，檸檬酸也會(huì)平行地得以降解，有些乳酸菌的作用會(huì)產(chǎn)生較多的乙酸。如果LF7菌株轉(zhuǎn)化檸檬酸為乳酸而不是以乙酸為主，這對(duì)桔酒品質(zhì)是有利的。

注：前4個(gè)為標(biāo)準(zhǔn)品，后4個(gè)為果汁及果酒樣品。圖6 果酒樣品主要有機(jī)酸紙層析分析

3　結(jié)論

以檸檬酸為碳源，從食品樣品中篩選出能利用檸檬酸的細(xì)菌菌株，通過(guò)接種量、初始糖度、酒精度、氧氣和溫度等條件的實(shí)驗(yàn)，顯示都對(duì)降酸效果有影響。在原酒酒精度5 %vol、糖度16 g/L、降酸溫度20℃條件下，處理6 d后酸度為5.7 g/L（以檸檬酸計(jì)），較原酒酸度下降29.7 %。紙層析分析結(jié)果顯示，該降酸過(guò)程中檸檬酸被完全降解和轉(zhuǎn)化，經(jīng)感官品評(píng)降酸酒樣具有酸度適宜、果香純正、酒香協(xié)調(diào)的特點(diǎn)。

研究中采用了16 g/L殘?zhí)堑脑?。根?jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，殘?zhí)撬接绊懡邓嵝Ч?，因此，如果進(jìn)一步在更低（＜4 g/L）糖度下進(jìn)行降酸處理，降酸效果可能更好。另外，pH值對(duì)降酸的影響在蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵中非常重要，一般認(rèn)為，pH3.2～3.8時(shí)可以有效實(shí)現(xiàn)蘋(píng)果酸乳酸發(fā)酵。本研究中，桔酒pH值一般保持在3.5～3.6，實(shí)驗(yàn)采用的原酒pH3.58。在該pH值條件下，采用LF7降酸能表現(xiàn)出良好的降酸效果。

參考文獻(xiàn)：

[1]王貴元,倪麗.荊州地區(qū)6個(gè)柑橘品種成熟期果實(shí)品質(zhì)的比較[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014,20(1)：99-101.

[2]潘曉飚,馮春梅,莫云彬,等.高橙果酒降酸技術(shù)研究[J].釀酒科技,2006(7)：65-67.

[3]朱蓮珍,沈治平.中國(guó)主要柑桔品種的營(yíng)養(yǎng)成分[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 1957,2(1)：61-69.

[4]趙玉平,杜連祥,劉麗麗,等.降解山楂汁中檸檬酸酵母菌的篩選及其降解特性研究[J].微生物學(xué)報(bào), 2004, 44(2)：235-239.

[5]王立芳,張微,文連奎.可降解L-蘋(píng)果酸和檸檬酸菌株的篩選及鑒定[J].食品科學(xué), 2010,31(21)：279-282.

[6]張規(guī)富,謝深喜.柑橘果實(shí)檸檬酸代謝研究進(jìn)展[J].中國(guó)園藝文摘, 2012(8)：1-3.

[7]趙淼,吳延軍,蔣桂華,等.柑橘果實(shí)有機(jī)酸代謝研究進(jìn)展[J].果樹(shù)學(xué)報(bào), 2008,25(2)：225-230.

Screening of a Deacidifying Bacterial Strain for Orange Wine & Study on Its Properties

DAI Xiaofang, LIU Fei, HOU Zhihua, WU Meng, CHEN Maobin and ZHEN Da
（Key Lab of Fermentation Engineering of Ministry of Education, Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan, Hubei 430068, China）

Abstract：In order to achieve the deacidification of orange wine by biological method, 14 bacterial strains with application potentials were preliminarily separated from various sources using citric acid as substrate in MRS medium. Then a quality strain LF7 was screened out through orange wine deacidification test and it was identified as Lactobacillus plantarum. A certain amount of LF7 was inoculated after the fermentation of orange wine and five factors including temperature, oxygen conditions, sugar content, alcohol content, and LF7 inoculating quantity would influence the acidification of orange wine. As the temperature was at 20℃, initial sugar content was 16 %, and alcohol content was 5 %vol, total acids dropped by 29.7 % after 6 d fermentation. Paper chromatography analysis showed that citric acid in wine sample was decomposed thoroughly.

Key words:deacidifying bacteria; orange wine; total acid; citric acid; fruit wine

通訊作者：鎮(zhèn)達(dá)（1968-），男，湖北松滋人，副教授，E-mail：davezhen2010@163.com。

作者簡(jiǎn)介：戴小芳（1992-），女，大學(xué)本科。

收稿日期：2015-10-08；修回日期：2016-01-17

DOI：10.13746/j.njkj.2015392

中圖分類(lèi)號(hào)：TS262.7；TS261.4；TS261.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016)04-0059-03

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1339.003.html。