牛希躍，任曉鏷，葉　林，蘭鴻珠，許　倩（.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300)

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響應(yīng)面法優(yōu)化酵母增殖培養(yǎng)基

牛希躍1，2，任曉鏷1，2，葉林1，2，蘭鴻珠1，許倩1，2
（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300)

摘要：為評價培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、生長因子等)對酵母菌生長量的影響，利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)研究主要影響因素，經(jīng)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定各因素峰值，再利用響應(yīng)面法優(yōu)化主要影響因素。結(jié)果表明，最適培養(yǎng)基配方為蔗糖58 g/L、蘋果汁22 mL/L、蛋白胨12 g/L、馬鈴薯汁10 mL/L、酵母粉10 g/L、氯化鈣0.1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L，在pH4.5條件下28℃培養(yǎng)24 h，酵母菌的生長量為8.8748 cfu/mL。優(yōu)化后的培養(yǎng)基與傳統(tǒng)的YPD培養(yǎng)基（8.5543 cfu/mL)相比，酵母菌菌數(shù)提高明顯。

關(guān)鍵詞：酵母；培養(yǎng)基；PB設(shè)計；響應(yīng)面

酵母菌為半子囊菌綱內(nèi)孢霉目酵母科酵母菌屬[1]，是一種單細(xì)胞真核微生物[2]。在發(fā)酵工業(yè)中，由于培養(yǎng)基種類繁多，培養(yǎng)基的成分對產(chǎn)物濃度、菌體生長都有重要影響，因此優(yōu)化微生物培養(yǎng)基就顯得尤為重要[3]。

響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM)優(yōu)化培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)設(shè)計步驟為：利用Plackett Burman（PB)實(shí)驗(yàn)篩選出幾個重要的影響因素對其進(jìn)一步研究[4]。用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，快速逼近最佳值區(qū)域[5]。通過BBD（Box Benken Design)或CCD（Central Composite Design)方法確定實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，利用統(tǒng)計分析軟件，確定最佳的實(shí)驗(yàn)條件及各因素間的相互作用。

黃麗金等[6]采用PB設(shè)計篩選出德氏乳桿菌保加利亞亞種LB14的生長強(qiáng)化因子為番茄汁、胡蘿卜汁以及關(guān)鍵因子——培養(yǎng)基的初始pH值。以旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計及響應(yīng)面法確定生長強(qiáng)化因子的最佳濃度及培養(yǎng)基的初始pH值。采用優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)，LB14的菌體濃度達(dá)到1.1×109cfu/mL，比優(yōu)化前的2.4×108cfu/mL提高了近5倍。

呂國英等[7]采用PB設(shè)計評價影響香菇多糖產(chǎn)量主要因素為葡萄糖、魚粉和KH2PO4；用最陡爬坡路徑逼近3個因素的最大響應(yīng)區(qū)域，通過Box-Behnken設(shè)計及響應(yīng)面分析確定了主要影響因素的最佳濃度。結(jié)果表明，優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，粗多糖產(chǎn)量為2.33 g/L，比初始培養(yǎng)基提高了1.91倍。

本實(shí)驗(yàn)以酵母菌為研究對象，以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，運(yùn)用PB法篩選影響酵母菌生長的主要因素。以篩選出的因素為變量，以酵母菌生物量為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳的培養(yǎng)基配比，從而提升酵母菌的收獲量。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株及耗材：分離自阿克蘇紅富士蘋果皮的酵母菌M19；阿克蘇紅富士蘋果；蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、磷酸氫二鉀、氯化鈉、酵母粉、氫氧化鈉等均為分析純。

V2200型分光光度計，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Hi2211型酸度計，意大利哈納儀器公司；HPX-9162 MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱、SWCJ-2FD型潔凈工作臺，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；EL204-IC型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海)有限公司；CX21FS1-2型生物顯微鏡，日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會社；JYL-0051型榨汁機(jī)，九陽股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化

將酵母M19接入YPD液體培養(yǎng)基中，活化3次后以3 %（106cfu/mL)的接種量接入到各培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h后測定菌體的生長量。

1.2.2 PB實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)選取7個影響因素作為研究對象，PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計表選用7因素，N=16次的實(shí)驗(yàn)表格，每組實(shí)驗(yàn)做3個平行，取平均值。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比較各因素對酵母菌生長量的影響。

1.2.3爬坡設(shè)計

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各個顯著影響因素效應(yīng)的大小來設(shè)定步長及變化方向，找出峰值，以逼近最佳響應(yīng)區(qū)域。

1.2.4中心組合設(shè)計

根據(jù)爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert軟件的旋轉(zhuǎn)中心組合法對主要影響因素進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析設(shè)計。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5統(tǒng)計與分析

運(yùn)用Design expert軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，并對擬合方程做顯著性檢驗(yàn)及方差分析。

1.2.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

比較M19在普通YPD培養(yǎng)基和響應(yīng)面法優(yōu)化的培養(yǎng)基中的生長量從而評價優(yōu)化后的培養(yǎng)基。

2　結(jié)果與討論

2.1 PB實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)研究結(jié)果[8]，本實(shí)驗(yàn)選取7個因素，蔗糖（X1)、蛋白胨（X2)、酵母粉（X3)、磷酸氫二鉀（X4)、氯化鈣（X5)、蘋果汁（X6)、馬鈴薯汁（X7)作為研究對象，PB實(shí)驗(yàn)選用7因素，N=16次的實(shí)驗(yàn)表格，影響因子及編碼見表1。利用Design expert軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比較各因素對酵母菌生長量的影響，篩選主要影響因素。

各影響因素主效應(yīng)分析結(jié)果見表2，從表2可以看出，7個因素中對響應(yīng)值（酵母菌菌數(shù))影響的順序依次為蘋果汁、蔗糖、蛋白胨、馬鈴薯汁、酵母粉、氯化鈣、磷酸氫二鉀。因此將馬鈴薯汁、酵母粉、氯化鈣、磷酸氫二鉀這4個顯著性較低的因素設(shè)定在一個較好的水平上，選擇蘋果汁、蔗糖、蛋白胨這3個因素進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 N=16的PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計因素水平及顯著性檢驗(yàn)

2.2爬坡實(shí)驗(yàn)

由PB實(shí)驗(yàn)可知（表2)，在酵母菌M19培養(yǎng)過程中，蔗糖因素產(chǎn)生了顯著影響，具有正效應(yīng)，應(yīng)增加；蘋果汁和蛋白胨都為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少[9-10]，根據(jù)這2個因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)計及結(jié)果見表3。

2.3響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

由最陡爬坡實(shí)驗(yàn)（表3)可知，第5組實(shí)驗(yàn)時酵母菌菌數(shù)獲得最大值，因此選定實(shí)驗(yàn)5的水平作為響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)[11]。利用Design Expert軟件中旋轉(zhuǎn)中心組合對酵母菌培養(yǎng)基進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析，因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4及表5。表5中的15個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)可以分為兩類：一是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計實(shí)驗(yàn)誤差；二是析因點(diǎn)，共有12個析因點(diǎn)，自變量在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)取值。

表3 爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表4 響應(yīng)面因素水平表

表5 實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

2.4數(shù)據(jù)分析

根據(jù)表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Design Expert軟件對下表進(jìn)行多元回歸分析，經(jīng)回歸擬合后，實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可以得到二次多項(xiàng)回歸方程：

式中：Y代表酵母菌菌數(shù)[Log（cfu/mL)]；Xa、Xb、Xc分表代表蘋果汁、蔗糖、蛋白胨。各項(xiàng)系數(shù)的絕對值大小反映各因素對響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映影響的方向[12]。

由該模型的方差分析（表6）可以看出，失擬項(xiàng)的P= 0.2575＞0.05，不顯著，說明本實(shí)驗(yàn)無其他顯著影響因素，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷氖M度好，可以用該模型分析預(yù)測酵母菌菌數(shù)[13]。模型的P值小于0.01（P=0.0001)，說明模型極顯著；用上述回歸方程來反映各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系，其自變量和因變量之間的線性關(guān)系是顯著的。

表6 二次多項(xiàng)回歸模型方程方差分析

表7 二次多項(xiàng)回歸模型方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

由表7可看出，Xb因素對酵母菌生長量的線性影響是顯著的，Xa2、Xb2、Xc2對酵母菌菌數(shù)的曲面效應(yīng)亦顯著；交互項(xiàng)中的XaXb對酵母菌菌數(shù)的交互效應(yīng)影響顯著[14]；其余影響不顯著，可以忽略，可得出回歸方程：

根據(jù)上述回歸方程作出的響應(yīng)面分析圖見圖1。

圖1為蘋果汁與蔗糖的等高線圖，因等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[15]，從其等高線圖可以看出此兩因素的交互作用顯著。由圖1可知，當(dāng)?shù)鞍纂说牧窟_(dá)到最好時（12 g/L)，蘋果汁的水平點(diǎn)為中心點(diǎn)24 mL/L時，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨著蔗糖量的增加，酵母菌菌數(shù)不斷增長，且曲線較陡，說明蔗糖量的變化對酵母菌菌數(shù)的影響較大。當(dāng)蔗糖的量增加到中心點(diǎn)附近時，酵母菌菌數(shù)達(dá)到最大；隨著蔗糖量的進(jìn)一步加大，酵母菌菌數(shù)減少，說明高濃度蔗糖對酵母菌的生長有抑制作用。當(dāng)蔗糖含量在中心點(diǎn)56 g/L時，酵母菌菌數(shù)隨著蘋果汁的增加而增加，在中心點(diǎn)附近達(dá)到最大值。之后隨著蘋果汁量的增加，酵母菌菌數(shù)增長較平穩(wěn)。

2.5驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證優(yōu)化培養(yǎng)基增菌效果的可靠性，用其進(jìn)行了5個平行的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，普通YPD培養(yǎng)基進(jìn)行了3個平行的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的菌數(shù)為8.8748 cfu/mL，而普通YPD培養(yǎng)基的菌數(shù)為8.5543 cfu/mL。

圖1 響應(yīng)面法（X1，X2)立體分析圖

3　結(jié)論與總結(jié)

通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定酵母菌（M19)最適生長溫度及pH值，然后用PB實(shí)驗(yàn)評價影響酵母菌生長的主要因素，篩選出具有顯著效果的3個因素分別為蔗糖、蘋果汁、蛋白胨。在此基礎(chǔ)上經(jīng)最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)找出其峰值，逼近最佳相應(yīng)區(qū)域后，對影響酵母菌生長量3個主要因素的最佳水平及其交互作用進(jìn)行了研究和探討，利用響應(yīng)面法優(yōu)化酵母菌培養(yǎng)基配方。最終得到最適培養(yǎng)基配方為蔗糖58 g/L、蘋果汁22 mL/L、蛋白胨12 g/L、馬鈴薯汁10 mL/L、酵母粉10 g/L、氯化鈣0.1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、溫度28℃，培養(yǎng)基pH4.5條件下培養(yǎng)3 d，酵母菌的生長量為8.8748 cfu/mL。優(yōu)化后的培養(yǎng)基與傳統(tǒng)的YPD培養(yǎng)基（8.5543 cfu/mL)相比，酵母菌菌數(shù)提高明顯。

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茅臺2016年一季度各項(xiàng)指標(biāo)均超兩位數(shù)增長

本刊訊：據(jù)《新華網(wǎng)》報道，從2016年3月14日召開的貴州全省白酒產(chǎn)業(yè)座談會上獲悉，貴州茅臺集團(tuán)在2016年一季度實(shí)現(xiàn)了超級旺季的銷售業(yè)績，各項(xiàng)指標(biāo)均超過兩位數(shù)的增長。

茅臺一季度各項(xiàng)指標(biāo)暴漲，預(yù)計一季度，茅臺集團(tuán)可完成增加值130億元左右，同比增長37 %以上，占全年計劃398億元的32 %；實(shí)現(xiàn)銷售收入150億元左右，同比增長41 %，占全年計劃436億元的34 %；實(shí)現(xiàn)利潤總額75億元左右，同比增長約26 %，占全年計劃231億元的32 %。

2016年茅臺集團(tuán)的總體目標(biāo)是完成工業(yè)增加值398億元，同比增長5 %左右；完成白酒產(chǎn)量7.8萬噸，其中茅臺基酒4萬噸；完成白酒銷量7.5萬噸，同比增長10 %以上；實(shí)現(xiàn)銷售收入436億元，同比增長4.2 %；實(shí)現(xiàn)利潤總額231億元，同比增長1.7 %，實(shí)現(xiàn)稅金165億元左右。（江源薦，駱佳龍編輯）

來源：新華網(wǎng)2016-03-18

Optimization of Yeast Culture Medium by Response Surface Method

NIU Xiyue1,2, REN Xiaopu1,2, YE Lin1,2, LAN Hongzhu1and XU Qian1,2
（1.College of Life Sciences, Tarim University,Alar, Xinjiang 843300；2. Key Lab of Deep-processing of Special Agricultural Products,Alar, Xinjiang 843300, China)

Abstract:In order to evaluate the effects of culture medium compositions（carbon source, nitrogen source, growth factors etc.) on the growth rate of yeast, the main influencing factors were determined by Plackett-Burman design. On the basis of the most steep climb path experiment, the peak values of those factors were determined and those factors were then optimized by response surface method as follows: sucrose 58 g/L, apple juice 22 mL/L, peptone 12 g/L, potato juice 10 mL/L, yeast powder 10 g/L, calcium chloride 0.1 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g/L, and the growth rate of yeast was 8.8748 cfu/mL after 24 h culture at 28℃and pH 4.5. Compared with traditional YPD culture medium （8.5543 cfu/mL), yeast quantity in the optimized culture medium increased by 2 times.

Key words:yeast; culture medium; PB design; response surface method

通訊作者：許倩，E-mail：xuqiantaru@126.com。

作者簡介：牛希躍（1978-），男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail：hljnxy@126.com。

收稿日期：2015-12-23

基金項(xiàng)目：兵團(tuán)工業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2014BA026）；南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（AP1503）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260393）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015476

中圖分類號：TS261.1；TS262.3；Q93-3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016)04-0047-04

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-02-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1326.002.html。