謝玉球，時　曉，周二干，苗秀珍，朱　超，葛向陽（.江蘇洋河股份有限公司，江蘇宿遷3800；.江南大學(xué)，江蘇無錫4）

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洋河大曲中糖化酶高產(chǎn)霉菌的篩選鑒定及固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

謝玉球1，時曉1，周二干1，苗秀珍1，朱超1，葛向陽2
（1.江蘇洋河股份有限公司，江蘇宿遷223800；2.江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

摘要：從洋河酒廠中高溫大曲中利用透明圈初篩得到5株霉菌，通過固態(tài)發(fā)酵測定酶活復(fù)篩的方法分離出1株產(chǎn)糖化酶且酶活性較高的霉菌菌株(編號YH-01)，根據(jù)其形態(tài)特征和ITS序列分析,該菌株為米曲霉(Aspergillus oryzae)。以該菌株為出發(fā)菌株，通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件，測得糖化酶在料水比5∶3、裝料量40 g/500 mL、發(fā)酵時間6 d時活力最高。

關(guān)鍵詞：微生物；洋河大曲；糖化酶；篩選；鑒定；固態(tài)發(fā)酵

糖化酶是淀粉糖化酶（Glucoamylase EC.3.2.1.3）的簡稱，又稱為γ-淀粉酶（γ- amylase），因發(fā)酵工業(yè)中大量用作淀粉糖化劑，習(xí)慣上簡稱糖化酶。糖化酶能從淀粉非還原性末端依次切下一個葡萄糖單位，將淀粉水解成葡萄糖，因此，它廣泛運用于酒精、白酒釀造、抗生素、氨基酸、有機酸、甘油、紡織、日化等生物工業(yè)中[1]。糖化酶是我國產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的酶制劑之一。在傳統(tǒng)的釀酒工藝中，采用的是自然接種，網(wǎng)羅自然界中的微生物[2]，不同微生物最佳生長和產(chǎn)酶條件不同，而制備強化大曲能夠有效的提高原料利用率、降低生產(chǎn)成本、縮短生產(chǎn)周期等。本實驗利用傳統(tǒng)的分離方法和分子生物學(xué)相結(jié)合，篩選出糖化酶活性強的菌種，為葡萄糖生產(chǎn)或制備強化大曲應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1材料

大曲樣取自江蘇洋河酒廠股份有限公司制曲廠房。

1.1.2主要藥品與試劑

硫酸銅（CuSO4·5H2O），次甲基藍，酒石酸鉀鈉，氫氧化鈉，亞鐵氰化鉀，0.1 %標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，2 %可溶性淀粉溶液，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH4.6），1 mol/L氫氧化鈉溶液，TE溶液，溶菌酶，SDS，蛋白酶K，飽和酚-氯仿，無水酒精，10×PCR緩沖液，dNTPs，Taq DNA聚合酶。

1.1.3儀器及設(shè)備

恒溫振蕩搖床，恒溫培養(yǎng)箱，數(shù)字滴定器，離心機，顯微鏡，恒溫振蕩水浴鍋，PCR擴增儀。

1.1.4培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：可溶性淀粉0.5 g，硝酸鈉3.0 g，磷酸氫二鉀1.0 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30.0 g，曲藥浸汁(取曲藥200 g，加入1000 mL水煮沸30 min，4層紗布過濾后抽濾至澄清)200 mL，瓊脂20.0 g，蒸餾水800 mL，氯霉素105 U，去氧膽酸鈉30.0 mg，pH6.0±0.2，0.1 MPa，121℃條件下滅菌20 min，冷卻至約50℃，倒6～7塊平板/100mL，冷卻備用。

圖1 初篩后各霉菌PDA平板菌落形態(tài)

PDA培養(yǎng)基：200 g土豆，洗凈去皮切成小塊，加水1000 mL，煮沸20 min,紗布過濾，濾液加水補足1000 mL，再加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂，在0.1 MPa，121℃條件下滅菌20 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮∶水=5∶3，攪拌均勻后取分裝到500 mL三角瓶中，每瓶45 g/500 mL，在0.1 MPa，121℃條件下滅菌20 min。

1.2實驗方法

1.2.1初篩

稱取5 g大曲粉，放入盛有45 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中。振搖10 min，振蕩混勻后靜置，吸取上清液1 mL加入9 mL無菌水試管中，依次進行梯度稀釋，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的溶液，吸取各梯度溶液0.1 mL于分離培養(yǎng)基上涂布均勻，置于30℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)3～4 d。觀察分離培養(yǎng)基平板長出的菌落周圍有無透明水解圈，取水解圈較大者接種于PDA平板上劃線分離至純種，菌種試管斜面保存。

1.2.2復(fù)篩

初篩中選擇水解圈較大的5株菌，進行復(fù)篩實驗，取直徑1 cm的各菌株霉菌瓊脂小塊放入霉菌固體培養(yǎng)基中搖晃均勻后，在30℃下培養(yǎng)3～7 d至長出孢子。

稱取相當(dāng)于5.0 g絕干曲的曲粉，放在250 mL三角瓶中，加水（90-5×水分%）mL，緩沖液10 mL，在30℃水浴中浸泡1 h，每隔15 min攪拌1次。然后用干濾紙過濾，棄去最初5 mL，接收50 mL澄清濾液備用得粗酶提取液后進行糖化酶活力的測定。酶活力越高，生產(chǎn)性能越好。

1.2.3高產(chǎn)糖化酶菌株的鑒定

菌株鑒定采用傳統(tǒng)絲狀真菌形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，以菌落特征、顏色和顯微形態(tài)為依據(jù)[3-5]，同時以研磨法提取的絲狀真菌染色體DNA為模板，擴增待鑒定菌株的ITS序列，采用BLAST搜索程序，把實驗中得到的實驗信息與基因庫中的基因序列進行比對，獲得同源性分析結(jié)果。

1.2.4菌株生產(chǎn)性能的單因素及正交實驗優(yōu)化

分別從料水比、裝料量、培養(yǎng)時間等因素通過單因素試驗對菌株培養(yǎng)條件進行比較后，確定出產(chǎn)酶條件較好的因素水平，采用L9(34)表進行正交試驗設(shè)計，以確定目標(biāo)菌株的最佳培養(yǎng)條件。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株篩選結(jié)果

從洋河大曲中選擇水解圈較大的5株霉菌，圖1為這5株霉菌在PDA平板上分離純化后的菌落形態(tài)。經(jīng)過復(fù)篩，測得酶活（見圖2）。YH-01的糖化酶活性在3～6 d內(nèi)為最高，在6 d時達到最高，為3683.34 U/g；其次是菌株2-005、0-002、0-001。

圖2 各霉菌糖化酶活力曲線

2.2鑒定

菌株在PDA培養(yǎng)基上生長快，表面初期呈白色、黃色或淡黃綠色，后變黃褐色，菌絲呈黃綠色，顯微鏡下觀察菌絲有隔膜、分生孢子梗下有足細胞。初步鑒定為曲霉。菌落如圖1中YH-01，菌絲體、孢子囊見圖3、圖4。

通過16S rDNA基因序列分析，菌株測序鑒定blast比對結(jié)果見圖5。YH-01菌株為米曲霉（Aspergillus oryza）。

2.3不同料水比對菌株產(chǎn)糖化酶的影響

選取酶活最高的菌株YH-01作為實驗菌株。料水比設(shè)置為5∶1、5∶2、5∶3、5∶4、5∶5，按上述料水比加水，料水混合均勻后，按照45 g/500 mL的裝料量，分裝到500 mL三角瓶中，0.01 MPa滅菌20 min，冷卻后接種，接種量按1.2.2方法進行，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，取樣測定糖化酶活力，結(jié)果見表1。

圖3 菌絲體

圖4 分生孢子梗及孢子囊

圖5 YH-01的測序鑒定blast比對結(jié)果

由表1可以看出，料水比在5∶3時，YH-01酶活最高，微生物的一切生化反應(yīng)都離不開水，適宜的水分含量直接影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率，且米曲霉是好氧的微生物，當(dāng)料水比低于5∶3，麩曲中心含有未被消耗的淀粉顆粒，料水比在5∶3時，麩皮濕潤疏松，通氣性好，觀察發(fā)現(xiàn)菌絲均勻密集，曲呈棉絮狀，不易搖散，當(dāng)料水比高于5∶3時，原料發(fā)黏，透氣性差，不利于菌絲的生長。資料表明[6]，營養(yǎng)菌絲是酶的主要來源，氣生菌絲或分生孢子梗酶活很低或根本沒有，因此，曲霉菌絲生長越旺盛，酶活相對就會高些。因此，采用5∶3的料水比做后續(xù)試驗。

表1 不同料水比對YH-01產(chǎn)糖化酶的影響

2.4不同裝料量對菌株產(chǎn)糖化酶的影響

按照料水比5∶3，分別以35 g/500 mL、45 g/500 mL、55 g/500 mL和65 g/500 mL、75 g/500 mL的裝料量制備成固體培養(yǎng)基，接種后，30℃恒溫培養(yǎng)4 d，取樣測定糖化酶活力，結(jié)果見表2。

表2 不同裝料量對YH-01產(chǎn)糖化酶的影響

由表2可以看出，隨著裝料量的增加，目的菌株酶活降低，在沒用搖床培養(yǎng)的情況下，裝料量越少，越有利于霉菌菌絲的大量生長，但是裝料量太少，原料間距大，不利于菌絲的生成，且浪費試驗用三角瓶數(shù)量，而裝料量越多易造成菌絲生長不均勻，浪費原料，因此，選擇裝料量為45 g/500 mL。

2.5不同發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)糖化酶的影響

料水比5∶3，裝料量45 g/500 mL，滅菌冷卻后接種，從第3天開始取樣測定糖化酶活力，結(jié)果見表3。

表3 不同發(fā)酵時間對YH-01產(chǎn)糖化酶的影響

由表3可以看出，從第3天開始，YH-01菌株的糖化酶活力在3～6 d內(nèi)隨著培養(yǎng)時間的增加，糖化酶活力呈直線上升趨勢，于第6天達到峰值3683.34 U/g干曲，之后隨營養(yǎng)物質(zhì)消耗和水分減少及孢子數(shù)增加，酶活力則快速下降。因此，YH-01菌株麩曲培養(yǎng)6 d酶活性最高。

2.6目標(biāo)菌株生產(chǎn)性能的正交試驗優(yōu)化

通過單因素發(fā)酵產(chǎn)酶試驗確定，在料水比5∶3、裝料量45 g/500 mL、培養(yǎng)時間為6 d時，米曲霉所產(chǎn)糖化酶活性最大。因此，試驗采取不同料水比、裝料量、發(fā)酵時間3個因素，每一因素選擇3個水平，以期獲得最佳產(chǎn)酶條件，試驗設(shè)計和結(jié)果見表4、表5。

表4 目標(biāo)菌株產(chǎn)酶條件正交試驗因素水平表

表5 目標(biāo)菌株產(chǎn)酶條件正交試驗結(jié)果

由表5可知，YH-01產(chǎn)糖化酶最佳工藝組合為：A2B1C2，即料水比為5∶3，裝料量為40 g/500 mL，發(fā)酵時間6 d。3個因素對YH-01產(chǎn)糖化酶活強弱順序依次為A＞B＞C，即料水比＞裝料量＞發(fā)酵時間。

3　結(jié)論

從洋河大曲中分離出5株糖化力較高的菌株，其中酶活最高的菌株YH-01經(jīng)過分子鑒定為米曲霉，以YH-01作為出發(fā)菌株進行固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化，該菌株在料水比5∶3、裝料量40 g/500 mL、發(fā)酵時間6 d時酶活最高，糖化酶活力為3875.06 U/g干曲。將進一步對該菌株酶的形成條件以及其固體發(fā)酵產(chǎn)酶的溫度、pH值、接種量、翻曲時間等進行條件優(yōu)化，提高產(chǎn)酶率。因米曲霉具有較為豐富的酶系，擁有較高的蛋白酶活性，后續(xù)將研究不同曲料pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間對米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響，最終制備強化大曲應(yīng)用于釀酒生產(chǎn)。

參考文獻：

[1]武金霞,王沛,李曉明.糖化酶的研究進展及趨勢[J].自然雜志, 2003,25(3)：161-163.

[2]肖冬光.白酒生產(chǎn)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[3]陳聲明,張立欽.微生物學(xué)研究技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社, 2006.

[4]喬宗偉,張文學(xué).濃香型白酒糟醅微生物分離培養(yǎng)基的選擇和研究[J].釀酒科技, 2004(6)：30-32.

[5] Lane D J, Pace B, Olsen G J, et al. Rapid determination of 16S ribosomal RNAsequences for phylogenetic analyses[J]. Proc Natl Acad Sci,1985,82：6955-6959.

[6]康明官.日本清酒技術(shù)[M].北京：輕工業(yè)出版社,1986：35-36.

Separation and Identification of Mold Strain with High-Yield of Glucoamylase from Yanghe Daqu and Optimization of Its Solid-State Fermentation Conditions

XIE Yuqiu1, SHI Xiao1, ZHOU Ergan1, MIAO Xiuzhen1, ZHU Chao1and GE Xiangyang2
(1.Yanghe Distillery Co.Ltd., Suqian, Jiangsu 223800; 2.Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122,China)

Abstract:Five mold strains were separated from Yanghe Daqu by transparent circle primary screening, then a strain YH-01 with high-yield of glucoamylase was separated from the five strains by measurement of enzyme activity after solid fermentation. According to its morphological characteristics and ITS sequence analysis, YH-01 was Aspergillus oryzae. Through single factor test and orthogonal tests, solid fermentation conditions of YH-01 were optimized and summed up as follows: the ratio of bran and water was 5∶3, loading capacity was 40 g/500 mL, and 6 d fermentation time. Under above conditions, the activity of glucoamylase was the highest.

Key words:microbe; Yanghe Daqu; glucoamylase; screening; identification; solid-state fermentation

通訊作者：苗秀珍，碩士，研究方向：工業(yè)微生物育種，E-mail：bilbobaggins@126.com。

作者簡介：謝玉球(1957-)，男，江蘇宿遷人，高級工程師，高級評酒師，國家白酒評委，現(xiàn)任江蘇洋河酒廠股份有限公司總工藝師。

收稿日期：2016-02-02

DOI：10.13746/j.njkj.2016040

中圖分類號：TS262.3；TQ925.7；Q93-3

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286(2016)04-0039-04

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.ts.20160304.1442.008.html。