于淼　張丹妹　鄔繼紅　圖婭　史榕荇　許明敏　郭郁　張旭輝　王瑜　張春濤　趙冰驄

100029　北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院[于淼(碩士研究生)、鄔繼紅、圖婭、許明敏(碩士研究生)、郭郁(碩士研究生)、張旭輝(博士研究生)、王瑜(博士研究生)、張春濤(碩士研究生)、趙冰驄(碩士研究生)]；鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院康復科(張丹妹)；中日友好醫(yī)院針灸科(史榕荇)

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·論著·

電針對慢性應激抑郁模型大鼠海馬神經血管生成相關蛋白的表達影響

于淼張丹妹鄔繼紅圖婭史榕荇許明敏郭郁張旭輝王瑜張春濤趙冰驄

100029北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院[于淼(碩士研究生)、鄔繼紅、圖婭、許明敏(碩士研究生)、郭郁(碩士研究生)、張旭輝(博士研究生)、王瑜(博士研究生)、張春濤(碩士研究生)、趙冰驄(碩士研究生)]；鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院康復科(張丹妹)；中日友好醫(yī)院針灸科(史榕荇)

【摘要】目的觀察電針對慢性應激抑郁模型大鼠海馬血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)、基質金屬蛋白酶8(matrix metalloproteinase-8， MMP-8)、基質金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)表達的影響，探討在慢性應激下電針對抑郁模型大鼠海馬神經血管的保護效應。方法將40只雄性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、電針組、氟西汀組，每組10只。除空白組外，其余組均采用慢性應激結合孤養(yǎng)方法造模28天，電針組和氟西汀組分別于造模前1小時進行電針干預和藥物治療。運用生物素標記蛋白抗體芯片技術，篩選出差異蛋白VEGF、VEGF-C、MMP-8和MMP-13。結果與空白組比較，模型組大鼠海馬VEGF、VEGF-C、MMP-8、MMP-13蛋白表達上升(fold change=1.20，1.34，1.25，1.31)。與模型組比較， 電針組與氟西汀組：VEGF蛋白表達水平下降(fold change=0.73，0.70)；VEGF-C蛋白表達水平下降(fold change=0.66，0.59)，MMP-8表達水平下降(fold change=0.70，0.58)，MMP-13表達水平下降(fold change=0.74，0.63)。結論電針能夠減輕慢性應激對大鼠海馬的影響，對神經和血管具有保護作用，這可能是電針抗抑郁作用的分子機制之一。

【關鍵詞】電針；抑郁癥；海馬；血管內皮生長因子；基質金屬蛋白酶

抑郁癥又稱情感性精神障礙，是一種由生物、心理、社會以及遺傳等多種原因導致的常見的精神疾病，其慢性、易復發(fā)、高致殘致死率的特點給個人和社會都造成了顯著的影響[1]，因此加強對抑郁癥的研究和治療具有非常重要的現實意義。

現如今治療抑郁癥臨床以藥物治療為主，但不同程度毒副作用和禁忌癥的缺陷嚴重制約了抑郁癥的治療效果。而大量臨床研究表明，電針能明顯改善抑郁癥患者的軀體癥狀，減輕藥物的不良反應，其療效肯定，經濟方便等特點受到人們的認可[2]，由于針刺抗抑郁機制較為復雜且尚不明確，從而引發(fā)對針刺抗抑郁機制研究的必要性。

抑郁癥的發(fā)病機制錯綜復雜，其發(fā)生發(fā)展涉及機體神經免疫內分泌等多個環(huán)節(jié)，既有基因的改變，也存在著蛋白的變化，而這兩者反映著生命機體的整體功能狀態(tài)。運用生物芯片技術從基因和蛋白等微觀角度觀察研究抑郁狀態(tài)下的整體失衡，這為開展針刺抗抑郁研究提供了更為廣闊的前景。

生物素標記抗體蛋白芯片技術是一種微量分析技術，其重要的特點是高通量并進行分析，適用于蛋白質—蛋白質、蛋白質—小分子物質間的相互作用的分析，可以在一次實驗比較生物樣品中上千的蛋白質的相對豐度，極大促進蛋白質組學研究進程。本實驗通過建立慢性輕度不可預見性應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型，選取氟西汀作為陽性對照藥物，通過電針治療干預，采用抗體蛋白芯片技術篩選在干預作用下有顯著表達變化的蛋白，并著重關注了同時在電針和藥物的干預治療下皆有顯著變化的與神經血管生成相關的VEGF、VEGF-C和與損傷機制相關的MMP-8、MMP-13，重點探討在慢性應激下，電針對神經血管生成和損傷的干預效應，旨在探究針刺的相關抗抑郁機制。

1材料與方法

1.1動物

SD清潔級雄性大鼠40只,體質量(200±20) g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2004-2007。

1.2藥物、試劑與儀器

鹽酸氟西汀分散片(禮來蘇州制藥有限公司，批號：J20120001)。RayBio大鼠L系列抗體芯片測試盒(美國RayBiotech公司)，AAR-BLM-1抗體芯片，標記試劑，終止液，封閉緩沖液，紅外熒光劑——鏈霉親和素，20X的洗液I，20X 的洗液II。恒溫箱(上海一恒科技有限公司，型號：BPH-9082)，酶標儀(美國BioTek，型號：ELX800)，離心機(美國Thermo Scientific，型號：SoRVALL LEGEND MICRO 21R)，勻漿機(德國IKA，型號：T10 basic ULTRA-TURRAX)，搖床(江蘇QILIN BEI ER，型號：TS-8)，芯片配套產品(膜芯片2張、塑料薄片、透析管2個、純化柱2個、孵育盒1個)，紅外熒光掃描儀LI-COR Odyssey Scanner(美國LI-COR公司)，華佗牌SDZ-V型的電針儀。環(huán)球牌無菌針灸針(0.30 mm×25 mm蘇州環(huán)球針灸醫(yī)療器械有限公司)。

1.3方法

1.3.1分組大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，將40只大鼠隨機分為空白組、模型組、模型+電針組(以下簡稱電針組)、模型+鹽酸氟西汀組(以下簡稱氟西汀組)，每組10只。

1.3.2模型制備與干預采用CUMS抑郁動物模型造模方法，空白組每籠5只，正常飼養(yǎng)，不接受任何刺激；模型組、電針組和藥物組的大鼠置于小籠中孤養(yǎng)并接受28天各種不同刺激，包括冰水游泳(4℃，5分鐘)、潮濕墊料、禁水(24小時)、夾尾(1分鐘)、束縛(3小時)、禁食(24小時)和晝夜顛倒共7種刺激。每天隨機給予1種刺激，相同的刺激不連續(xù)出現，每種刺激總共不少于4次。電針組在每天應激前1小時進行電針干預，氟西汀組在每天應激前1小時進行藥物灌胃干預。

1.3.3針刺與給藥方法根據《實驗針灸學》選取百會、印堂。選用“環(huán)球”牌0.30 mm×25 mm針刺針，平刺進針，針刺深度為0.5～1 cm，電針強度為2 Hz，斷續(xù)波，30 min/次，針刺強度以大鼠頭部微顫為宜。氟西汀用蒸餾水配成10 mg/kg，按5 mL/kg濃度灌胃。

1.4取材及檢測方法

1.4.1取材造模28天后，灌流固定，取腦。將每組的大鼠海馬組織進行混合，利用透析管透析，測定相關蛋白濃度，用生物素進行標記。經過封閉和孵育后，利用紅外熒光掃描儀進行掃描。運用儀器自帶分析軟件提取數據。

1.4.2抗體蛋白芯片技術檢測(1) 海馬組織裂解液置備：用pH 7.4的PBS洗凈海馬組織，剪碎放至離心管，加入500 μL細胞裂解液，勻漿機裂解組織30秒，取上清移至新的離心管中保存。(2)樣品透析：取200 μL組織裂解液加入透析管中，之后在4000 mL的1×PBS(pH=8)中4℃邊攪拌邊透析。每3小時更換透析液1次。(3)蛋白濃度測定：采用BCA蛋白濃度測定試劑盒，檢測海馬組織裂解液蛋白濃度。(4)生物素標記樣品：先將標記試劑小管快速離心，管中加入500 μL的1×PBS溶解粉末，制備成1×標記試劑溶液。再向新的離心管中加入適當量的標記試劑?？焖倩靹?，搖床上室溫孵育30分鐘。每5分鐘輕彈離心管，混合反應試劑。加入5 μL終止液，然后用純化柱去除未結合生物素，再將擰開蓋子與底部栓的柱子放入50 mL收集管中，于1000 g離心3分鐘去掉儲存液。之后向柱中加入5 mL的1×PBS，于1000 g離心3分鐘，倒出50 mL離心管中的5 mL 1×PBS，再重復2次此步操作，清洗干凈柱子。將柱子放入一個新的50 mL離心管中，緩慢將標記好的樣品加入樹脂床的中央。將柱子離心后收集樣品，儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?5)封閉和孵育：在孵育盒中加入2.5 mL封閉緩沖液，用鑷子拖著膜的邊緣將膜緩慢浸沒到封閉緩沖液中，避免氣泡產生，室溫振蕩孵育1小時。 用抽液泵抽去封閉液后，每張膜芯片加入2.5 mL封閉液稀釋好的樣品，4℃過夜。抽去樣品，每個孵育盒中加入約3 mL的1×洗液I(20×洗液用去離子水稀釋)室溫振蕩洗膜，洗膜4次，每次5分鐘。抽去1×洗液I，加入1×洗液II室溫振蕩洗膜，洗膜3次，每次5分鐘。抽去1×洗液II，每張膜加入2.5 mL用封閉液8000倍稀釋的CW800-鏈霉親和素。室溫避光振蕩孵育2小時。洗膜(步驟同上)。(6)抗體芯片信號的檢測：使用LI-COR Odyssey Scanner 進行掃描，設定波長為800掃描通道，掃描強度為7.0，分辨率為42 μm。

1.5統(tǒng)計學處理

用儀器自帶分析軟件提取數據，采用AAR-BLM-1的數據分析軟件來進行數據預分析。將每組10個樣品進行混合，采用蛋白表達水平變化(fold change)比較方法，即兩組樣本蛋白表達量均值之比的方法進行差異分析，直觀地表現組間的蛋白表達差異，選取差異蛋白最多的“fold change大于1.2或小于0.8”檔位進行分析，并進行組間校正。

2結果

造模4周后，與空白組相比，模型組大鼠海馬VEGF蛋白表達上調(fold change=1.20)；相較于模型組，電針組、氟西汀組VEGF表達下調(fold change=0.73，0.70)。與空白組相比，模型組大鼠海馬VEGF-C蛋白表達上調(fold change=1.34)；相較于模型組，電針組、氟西汀組VEGF-C表達下調(fold change=0.66，0.59)。與空白組相比，模型組大鼠海馬MMP-8蛋白的表達上調(fold change=1.25)；與模型組相比，電針組、氟西汀組MMP-8表達下調(fold change =0.70，0.58)。與空白組相比，模型組大鼠海馬MMP-13蛋白的表達上調(fold change=1.31)；與模型組相比，電針組、氟西汀組MMP-13表達下調(fold change =0.74，0.63)。具體見表1和圖1～圖4。

表1　各組大鼠海馬血管生成相關蛋白比較

表2　各組蛋白表達量均值之比

注： 與空白組相比，afold chang>1.2;與模型組相比，bfold chang<0.8

3討論

抑郁機制與治療研究選擇恰當的動物模型是一個實驗的基礎，本實驗采用CUMS慢性溫和不可預知應激抑郁模型，它可以模擬人類抑郁癥中各種慢性應激源導致抑郁癥的發(fā)生發(fā)展過程[3]，是目前公認的經典抑郁癥動物模型之一[4]。

A空白組 B模型組 C電針組 D氟西汀組

A空白組 B模型組 C電針組 D氟西汀組

A空白組 B模型組 C電針組 D氟西汀組

A空白組 B模型組 C電針組 D氟西汀組

抗體芯片技術是檢測生物樣品中蛋白表達模式的新方法，它的顯著優(yōu)點是可以在同一張芯片上對成百上千種不同樣品的蛋白表達模式進行分析比較。對于抑郁癥研究，這項技術可以同時比對不同組間大鼠的多種蛋白，為篩選表達有差異的蛋白提供了良好的技術支持及可靠的實驗依據，也給予了后期的研究方向。本實驗在慢性應激模型大鼠上，運用此技術，同時對比四個組大鼠海馬內的蛋白，發(fā)現部分蛋白表達水平出現了不同程度的上調或下調，本課題組前期著重探討星形膠質細胞功能改變對抗抑郁作用的影響[5]及電針抗抑郁的機制可能與促進了海馬內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有關[6]。本實驗延續(xù)前期并重點關注與神經血管生成密切相關的VEGF/VEGF-C、MMP-8/MMP-13的蛋白表達水平，發(fā)現二者無論在模型組與空白組比較中，還是電針組、藥物組與模型組比較中蛋白表達均有顯著的變化，推測電針可能通過抑制MMP-8/MMP-13的蛋白表達從而降低應激狀態(tài)下病理性血管的生成和神經細胞外基質的降解，同時對神經血管產生保護效應，從而良性調節(jié)VEGF/VEGF-C的蛋白表達水平，發(fā)揮抗抑郁的作用。

血管內皮生長因子家族具有增加微靜脈、小靜脈的通透性，促進血管內皮細胞分裂、增殖，以及誘導血管生成等作用。通常所說VEGF即指VEGF-A。其中VEGF-A及VEGF-C是主要成員，VEGF-A是最早發(fā)現的，其促進血管生成的作用也最強。在腦內，VEGF與神經、血管再生聯(lián)系緊密，它能特異性地通過提高血管通透性、促進內皮細胞分裂、增殖及遷移，在血管新生形成過程發(fā)揮重要作用[7]，此外，它還具有促進內皮細胞存活與抗凋亡的作用。而且越來越多的研究表明VEGF影響海馬神經的發(fā)生，它主要通過參與海馬神經元細胞內的多條信號通路促進海馬神經元前體生存、滲透、遷移和增殖[8]。Palmer等[9]研究中發(fā)現海馬中含有較高水平的VEGF，由此VEGF很可能直接促進了神經細胞的增殖；也有可能通過刺激內皮細胞增殖，間接地誘導神經祖細胞的分裂。在調節(jié)血管生成方面VEGF-C與VEGF有相同的作用：能刺激內皮細胞遷移和增生，增加血管通透性，同時它還表現出與VEGF的協(xié)同作用[7]。

許多研究表明，抑郁大鼠海馬內VEGF的表達降低[10-11]，但也有研究發(fā)現抑郁癥患者與健康人相比VEGF水平升高[12-14]，且有研究證實缺氧、缺血及實體腫瘤等情況下可以提高VEGF的表達[15-16]，并且在某些病理狀態(tài)也有VEGF合成增加的情況。本實驗中，通過篩查發(fā)現，模型組大鼠海馬VEGF、VEGF-C蛋白表達水平上調，推測應激狀態(tài)下，造成了神經血管的損傷和凋亡，而機體可能通過升高VEGF、VEGF-C的途徑促進血管和神經的再生，從而啟動了機體的神經血管保護機制，以拮抗應激對抗神經血管的損傷；電針干預后，大鼠海馬的VEGF/VEGF-C蛋白表達趨于正常水平。推測電針治療可通過某種途徑減輕了慢性應激對大鼠海馬神經和血管的損傷，使大鼠腦內穩(wěn)態(tài)趨于正常，從而良性調節(jié)了VEGF及VEGF-C的蛋白表達。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein, MMPs)是一個可以降解細胞外基質不同成分的鋅依賴蛋白家族[17]，它們在生理和病理性血管生成中發(fā)揮重要作用。MMP-8在內皮細胞、干細胞等多處表達[18]，并且在血管組織中非?；钴S，可以使內皮細胞功能變得敏感[19]，同時它還會促使血管結構破壞，功能紊亂，分布無序的病理性血管生成[20]。在中樞神經系統(tǒng)，MMP-13來自神經膠質細胞，神經元及腦血管內皮細胞，其活化可通過降解神經細胞外的基質，從而破壞腦神經細胞和血管的完整性[21]，并且在某些病理狀態(tài)也有MMP-13合成增加的情況[22-23]。本實驗發(fā)現：CUMS大鼠海馬內MMP-8、MMP-13明顯高于正常組，而經過電針干預后的大鼠海馬內這兩種蛋白表達會顯著降低。電針可能通過下調MMP-8、MMP-13的蛋白表達水平，從而抑制了慢性應激導致的神經細胞外基質的降解及病理性血管的生成，改善了神經血管的損傷，對神經細胞和血管行使保護的效應。

本實驗中從電針對神經血管保護效應的角度，從篩查的蛋白中關注和分析了與神經血管密切相關的VEGF/VEGF-C及MMP-8/MMP-13,發(fā)現電針能夠通過啟動大鼠的神經血管保護機制，抵抗慢性應激對大鼠海馬的損害，維護海馬的穩(wěn)態(tài)，從而產生抗抑郁的作用。與神經血管保護相關的蛋白仍有許多，本文只從篩查蛋白中重點描述了VEGF、VEGF-C、MMP-8及MMP-13，對針刺抗抑郁作用的靶點和途徑的描述是遠遠不夠的，在今后的研究中，將繼續(xù)深入研究其他被篩查出來有顯著差異的與神經血管密切相關的蛋白，通過結合相關信號通路，繼續(xù)深入進行針刺的抗抑郁機制研究。

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(本文編輯： 董歷華)

Influence of electroacupuncture on the expression of related proteins in the hippocampus of rats with chronic stress induced depression

YUMiao，ZHANGDan-mei，WUJi-hong，etal.

SchoolofAcu-moxibustionandTuina，BeijingUniversityofChinese

medicine，Beijing100029，ChinaCorrespondingauthor：WUJi-hong，E-mail：wujihong@sohu.com；TUYa，E-mail：Tuyab@263.net

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of electric acupuncture (EA) on VEGF, VEGF-C, MMP-8 and MMP-13, which are relevant to angiogenesis and injuries in vessels and nerves in hippocampus of CUMS rats. The protective effect of electric acupuncture on the hippocampus neurons of rats with depression induced by chronic stress was explored. Methods40 SD rats were randomly divided into four groups：blank group，model group，EA group，and fluoxetine group. The chronic unpredictable mild stress model was established. Biotin-labeled protein chip technology were used to detect the expression of VEGF ,VEGF-C,MMP-8 and MMP-13. ResultsCompared with the blank group，the protein expressions of VEGF，VEGF-C, MMP-8 and MMP-13 in the model group were increased( fold change =1.20,1.34,1.25，1.31) . Compared with the model group，VEGF was decreased in EA group and fluoxetine group(fold change=0.73,0.70). VEGF-C was decreased in EA group and fluoxetine group (fold change=0.66, 0.59), MMP-8 was decreased in EA group and fluoxetine group (fold change=0.70, 0.58) and MMP-13 was decreased in EA group and fluoxetine group. ConclusionEA can reduce the influence of chronic stress on the hippocampus of rats, and has protective effect on nerve and vessels, which may be one of the molecular mechanisms of anti depression.

【Key words】Electric acupuncture；Depression；Hippocampus；VEGF；MMPs

(收稿日期：2015-09-07)

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.04.001

作者簡介：于淼(1989- )，女，2013級在讀碩士研究生。研究方向：影響針灸療效的相關因素研究。E-mail:guihebie@163.com通訊作者：鄔繼紅(1964- )，女，碩士，教授，副主任醫(yī)師，碩士生導師。研究方向：影響針灸療效的相關因素研究。E-mail：wujihong@sohu.com；圖婭(1955- )，女，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導師。研究方向：針刺抗抑郁機理與臨床研究。E-mail：Tuyab@263.net

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81173334，81373729)