徐敬軒　欒新平

【摘要】 目的 探討血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子（PD-ECGF）在頸動脈粥樣硬化剝脫術(shù)（carotid endarterectomy， CEA）術(shù)后再狹窄血管中的表達及其與管腔狹窄程度的相關(guān)性。方法 20只新西蘭清潔級白兔， 隨機分為對照組（5只）和實驗組（15只）， 建立兔頸動脈再狹窄模型， 取材后行免疫組織化學(xué)染色， 與對照組相比， 觀察實驗組PD-ECGF的表達， 并觀察其陽性表達強度與管腔狹窄程度的關(guān)系。結(jié)果 實驗組PD-ECGF陽性表達（>2分）13例， 陰性（≤2分）2例， 對照組陽性表達3例， 陰性12例， 對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；PD-ECGF陽性表達強， 其管腔狹窄程度較輕， 表達較弱時則相反。結(jié)論 PD-ECGF可能是血管再狹窄形成諸多因素中的一種起保護作用的因子， 可促進內(nèi)皮細胞的遷移， 從而抑制血管平滑肌的增殖。

【關(guān)鍵詞】 血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子；頸動脈粥樣硬化剝脫術(shù)；再狹窄血管

CEA是預(yù)防和治療缺血性腦卒中的主要手術(shù)方式， 但術(shù)后仍有再狹窄的發(fā)生， 周定標(biāo)[1]報道發(fā)生率為1%～31%， 如何有效的預(yù)防已成為困擾臨床醫(yī)生的一大難題。PD-ECGF是血小板中發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)皮細胞生長因子， 本研究通過對20只新西蘭白兔進行分組實驗， 從而探討該因子在CEA術(shù)后再狹窄血管中的表達及其與管腔狹窄程度的相關(guān)性， 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 新西蘭清潔級白兔20只， 隨機分為對照組（5只）和實驗組（15只）。其中對照組給予正常喂養(yǎng)6周后取材， 每只在頸動脈不同部位取3份， 共15份標(biāo)本作為對照；實驗組給予高脂喂養(yǎng)2周， 形成斑塊后行CEA術(shù)， 術(shù)后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)4周， 待再狹窄形成后取材。

1. 2 儀器與試劑 手術(shù)顯微鏡及顯微器械， 愛惜康可吸收縫線， LipofectamineTM2000；地高辛精（Dig-11-ddUTP）；PD-ECGF單克隆抗體；攜帶PD-ECGF質(zhì)粒的克??；大腸桿菌DH5a；分子克隆工具酶；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒；質(zhì)粒抽提試劑盒；SP試劑盒；分析醇。

1. 3 方法 ①實驗組頸動脈再狹窄模型建立方法：給予1 g膽固醇/（d·只）， 喂養(yǎng)2周。用3%戊巴比妥鈉3 mg/kg， 耳緣靜脈麻醉。頸部剃毛， 于甲狀軟骨下1 cm處， 沿頸白線切開皮膚約4 cm， 用顯微剝離子在動脈壁中膜層分離， 完整切除已分離的內(nèi)膜， 用縫合線連續(xù)縫合動脈切口， 縫合后動脈直徑應(yīng)不低于原血管直徑的85%， 用不含肝素的生理鹽水充盈管腔， 放開血管夾， 檢查無明顯出血后， 將頸總動脈放回原位， 縫合頸闊肌和頸部皮膚切口。生存動物術(shù)后繼續(xù)給予高膽固醇喂養(yǎng)4周。②血管標(biāo)本的制備：術(shù)后實驗組高脂喂養(yǎng)4周， 麻醉試驗動物后在無菌條件下銳性切下狹窄處血管約1.5 cm， 置冰上用肝素鹽水沖洗管腔內(nèi)血液， 4%多聚甲醛固定。③原位雜交組織化學(xué)染色檢測PD-ECGF的陽性表達：用Dig-11-ddUTP修飾合成好的寡核苷酸探針并純化。將各組石蠟包理切片浸入二甲苯10 rain移除石蠟， 用30 ?l 0.4 ng/?l的PD-ECGF mRNA的寡核苷酸探針液加在切片上， 過夜；滴加酶標(biāo)地高辛抗體（1：500）， 37℃30 min；加顯色液后顯色；二甲苯透明， DPX封固。④病理學(xué)檢查：取血管組織0.25 cm， 將其連續(xù)切片， 厚度為0.4 ?m， 行蘇木素-伊紅（HE）染色， 計算機病理圖像分析系統(tǒng)下觀察管腔狹窄率=（1-現(xiàn)存管腔面積/內(nèi)彈力膜以下面積）×100%。根據(jù)NASCET狹窄程度分級：輕度<30%， 中度30～69%， 重度70～99%。

1. 4 判定標(biāo)準(zhǔn) 顯微鏡下觀察， 陽性信號為紫藍色顆粒狀沉淀物分布于細胞漿中， 計數(shù)顯微高倍視野中陽性表達， 強度評分標(biāo)準(zhǔn)：無染色記0分；輕度染色記1分；中度染色記2分；強染色記3分。細胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)：無染色記0分；<25%染色記1分；25%～50%染色記2分；>50%染色記3分。評分之和>2分， 則為PD-ECGF表達陽性， ≤2分則為陰性。

1. 5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實驗組無染色1例， 輕度染色1例， 中度染色2例， 強染色11例；細胞比例：無染色1例， <25% 4例， 25%～50% 2例， >50% 8例。對照組無染色13例， 輕度染色1例， 中度染色1例， 無強染色；細胞比例：無染色13例；<25%2例；無>25%染色。實驗組陽性表達（>2分）13例， 陰性（≤2分） 2例； 對照組陽性表達3例， 陰性12例， 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.39， P<0.01）。對實驗組管腔狹窄程度觀察結(jié)果表明， PD-ECGF陽性表達強， 其管腔狹窄程度較輕， 表達較弱時則相反。

3 討論

PD-ECGF在血管生成領(lǐng)域中已被業(yè)界學(xué)者關(guān)注。目前血小板中已知的生長因子如PDGF， 表面生長因子（EGF）等， 均未發(fā)現(xiàn)具有促進內(nèi)皮生長作用， 而PD-ECGF因其釋放條件不同， 是血小板中目前發(fā)現(xiàn)唯一的內(nèi)皮細胞生長因子[2]， 在體內(nèi)血管生成中起著重要作用。

CEA術(shù)后造成管腔再狹窄的原因是術(shù)后內(nèi)膜斑塊被切除， 內(nèi)皮細胞缺失， 啟動了血栓形成、炎癥反應(yīng)、平滑肌細胞增殖和遷移等過程， 導(dǎo)致再狹窄的發(fā)生。其中心環(huán)節(jié)是血管平滑肌的過度增殖， 有學(xué)者通過體外實驗已證實PD-ECGF具有刺激和增強內(nèi)皮細胞遷移特性， 進而修復(fù)損傷、 維持血管穩(wěn)定[3]。國外腫瘤研究的相關(guān)文獻已證實， PD-ECGF可促進腫瘤血管內(nèi)皮細胞遷移， 而并未加重其對周圍的浸潤[4]。國內(nèi)也有學(xué)者證實， PD-ECGF能增強內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的遷移， 從而抑制平滑肌細胞的過度增殖[3]。

作者在前期工作中， 對頸動脈粥樣硬化斑塊形成的血管中PD-ECGF的表達進行觀察和對比， 已初步證實PD-ECGF在頸動脈粥樣硬化斑塊形成的血管中呈陽性表達， 但在CEA術(shù)后再狹窄形成的血管中如何， 尚未查閱到相關(guān)報道。本研究通過建立新西蘭兔頸動脈CEA術(shù)后再狹窄動物模型， 與對照組進行對比， 觀察再狹窄形成的血管中PD-ECGF的陽性表達情況， 同時結(jié)合病理， 進行再狹窄程度的觀察。研究結(jié)果顯示，PD-ECGF在再狹窄形成的血管中有陽性表達， 在其形成的過程中發(fā)揮一定的作用。而通過與病理檢查所示狹窄程度的觀察發(fā)現(xiàn)， 陽性細胞數(shù)百分數(shù)越低者， 血管管腔狹窄程度越嚴重， 而陽性細胞數(shù)百分數(shù)越高者， 管腔反而輕度狹窄， 說明PD-ECGF可能是血管再狹窄形成諸多因素中的一種起保護作用的因子， 可促進內(nèi)皮細胞的遷移， 從而抑制血管平滑肌的增殖。

總之， PD-ECGF可能抑制CEA術(shù)后血管再狹窄形成， 為開展基因轉(zhuǎn)染技術(shù)研究提供理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)， 因本研究樣本量有限， 尚缺乏說服力， 將在隨后開展的寡核苷酸轉(zhuǎn)染研究中進一步證實。

參考文獻

[1] 周定標(biāo).頸動脈內(nèi)膜切除術(shù).北京：人民軍醫(yī)出版社， 2005： 276-280.

[2] 李冰， 尚濤.血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子的研究進展.國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志， 2008， 35（2）：86-88.

[3] 朱晉坤， 毛華， 尹揚光， 等.血小板源性生長因子和血小板源性內(nèi)皮細胞生長因子在內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞中的作用研究.中國全科醫(yī)學(xué)， 2015， 9（9）：1023-1028.

[4] Bijnsdorp IV， Capriotti F， Kruyt FA， et al. Thymidine phosphorylase in cancer cells stimulates human endothelial cell migration and invasion by the secretion of angiogenic factors. Br J Cancer， 2011， 104（7）：1185-1192.

[收稿日期：2015-12-07]