歐朝萍，吳汝娟，馬咸瑩,王冬梅

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2. 西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730030)

產(chǎn)類胡蘿卜素菌株的分離與鑒定

歐朝萍1，吳汝娟1，馬咸瑩1,王冬梅2*

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2. 西北民族大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730030)

從植物落花土壤中分離篩選、純化出產(chǎn)紅色色素的菌株，以分離菌株為研究對(duì)象, 采用酸熱破壁法處理發(fā)酵菌體細(xì)胞，丙酮浸提色素，紫外分光光度計(jì)測(cè)定浸提物最大吸收波長，確定菌株是否產(chǎn)類胡蘿卜素.對(duì)目的菌株進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化及生理生化鑒定.從試樣中分離純化得到4株產(chǎn)色素菌株.僅J3菌株的丙酮浸提液的最大吸收波長在470 nm附近，確定該菌株代謝產(chǎn)物中含有類胡蘿卜素.營養(yǎng)肉湯—無機(jī)鹽復(fù)合培養(yǎng)基最適合其生長，類胡蘿卜素產(chǎn)量約為3.873 mg/L.初步鑒定J3菌株為戈登氏(gordonia)菌屬細(xì)菌.

產(chǎn)類胡蘿卜素菌株；菌株分離；菌株鑒定

類胡蘿卜素為40 碳的碳?xì)浠衔?胡蘿卜素)和它們的氧化衍生物(葉黃素)兩大類色素的總稱，在自然界中存在著600 多種類胡蘿卜素，在微生物、植物、動(dòng)物中廣泛存在[1]，其中以β-胡蘿卜素最為典型，作為維生素A 原的活性最強(qiáng)，被認(rèn)為是人體獲得必需的維生素A 的重要來源.在國內(nèi)，β-胡蘿卜素已作為安全著色劑列入中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).β-胡蘿卜素還作為一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑，廣泛添加到食品中[3].

利用微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素是獲得生物資源型類胡蘿卜素的最重要的途徑[1-5].目前，已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)類胡蘿卜素的菌株主要為光合細(xì)菌、霉菌、酵母和藻類.其中光和細(xì)菌需要光照，不適用發(fā)酵罐大量培養(yǎng).霉菌中較為普遍的有三孢布拉霉菌，由于其絲狀真菌的特點(diǎn)，導(dǎo)致其發(fā)酵調(diào)控工藝較為復(fù)雜.酵母如紅酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素的產(chǎn)量相對(duì)較低.藻類由于受產(chǎn)地和季節(jié)的限制，而無法大規(guī)模推廣.因此，有必要進(jìn)一步發(fā)掘新的種屬的類胡蘿卜素生產(chǎn)菌株.本實(shí)驗(yàn)從植物落花土壤中篩選、分離純化出產(chǎn)類胡蘿卜素菌株，以豐富天然胡蘿卜素的微生物資源.

1 材料與方法

1.1 菌種來源

從西北民族大學(xué)榆中校區(qū)的牡丹園、黑心葵園等處采集植物落花土壤試樣4份.方法：五點(diǎn)采集法采集地表下20 cm左右深處土壤10 g，裝入密封無菌塑料袋中，實(shí)驗(yàn)備用.

1.2 培養(yǎng)基及試劑

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖31.8 g/L、酵母粉5 g/L、(NH4)2SO42 g/L，,KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，無水CaCl20.1 g/L，NaCl 0.3 g/L，pH 7.0.

斜面培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯18 g/L，瓊脂粉20 g/L，自然pH.

營養(yǎng)肉湯：蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH.

3 mol/L鹽酸：7.8 mL蒸餾水+37%鹽酸22.2 mL.

丙酮、K2HPO4、Fe SO4、MgSO4、CaCl2、硝酸鉀等試劑均為AR.

1.3 設(shè)備

QHZ-98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱、MLS-3750全自動(dòng)高壓滅菌器、QHZ-98A干熱滅菌箱、UV-2300紫外分光光度計(jì)、冰箱、離心機(jī)等.

1.4 樣品的富集培養(yǎng)及混懸液制備

準(zhǔn)確稱取土樣5 g，放入盛有50 mL營養(yǎng)肉湯的250 mL三角瓶內(nèi)，37 ℃ 130 r/min,振搖培養(yǎng)24 h后，吸取1 mL的富集懸液，用無菌水倍比稀釋，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5幾種稀釋度的混懸液.

1.5 菌株的分離與純化

選取10-3、10-4、10-5三個(gè)稀釋度的混懸液各0.2 mL，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)20 h～48h.挑選平板上出現(xiàn)的紅色菌落，經(jīng)反復(fù)平板劃線，分離純化獲得純菌落，接種至斜面，冰箱保藏待用.

1.6 純化菌株的發(fā)酵

用接種針挑取適量斜面培養(yǎng)基保存菌株，接種于裝液量為50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)液中，35 ℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)20 h，獲得種子液.再按5%的接菌量將種子液接入裝液量為50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)72 h～96 h.

1.7 發(fā)酵液中色素的提取及最大吸收波長的檢測(cè)

采用酸熱破壁法處理菌體細(xì)胞[7].取10 mL發(fā)酵液進(jìn)行離心, 8 000 r/min離心 10 min，得到濕菌體.蒸餾水洗滌3次后，加入3 mol/L鹽酸15 mL，混勻后室溫下振蕩浸泡40 min，在沸水浴中煮5 min,迅速冷卻,8 000 r/min離心10 min, 棄上清液體.沉淀用蒸餾水洗滌 2～3次后加入4 mL丙酮溶劑，室溫下震蕩以浸提類胡蘿卜素.再5 000 r/min離心10 min,得上清液即為胡蘿卜素提取液.如細(xì)胞碎片中仍有色素，加提取溶劑進(jìn)一步浸提，合并提取液.將含色素的丙酮提取液在紫外分光光度計(jì)中掃描，得到最大吸收波長.

1.8 目的菌株的培養(yǎng)特性

選用營養(yǎng)肉湯、高氏、LB以及營養(yǎng)肉湯—無機(jī)鹽復(fù)合培養(yǎng)基等四種培養(yǎng)基對(duì)分離的目的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)量不同時(shí)間菌株的生物量(OD600 nm),繪制不同培養(yǎng)基下菌株的生長曲線.從曲線的趨勢(shì)來確定菌株的最適培養(yǎng)基.

各種培養(yǎng)基分別分裝至15支試管中，每支裝量為4 mL，接菌量100 μL，以不接菌管作為空白對(duì)照，每個(gè)樣設(shè)3個(gè)平行.試管置于30 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng).每間隔6小時(shí)取樣一次，測(cè)培養(yǎng)物的OD600 nm值.以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo), OD值為縱坐標(biāo)，繪制不同培養(yǎng)基下菌株的生長曲線.

選取優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的發(fā)酵培養(yǎng)，丙酮浸提類胡蘿卜素.稀釋提取液后，紫外分光光度計(jì)測(cè)得在最大吸收波長下的OD值，按下式計(jì)算色素產(chǎn)量：

類胡蘿卜素的產(chǎn)量(mg/L)=ODλmax×D×V/0.16×V0.

式中：OD為類胡蘿卜素在最大吸收波長處的吸光度值.V為提取色素所用的溶劑量；D為測(cè)定試樣時(shí)的稀釋倍數(shù)(10)；V0為所用的發(fā)酵液總體積；0.16為類胡蘿卜素的分子消光系數(shù).

1.9 目的菌株的初步鑒定

分別進(jìn)行分離菌株的形態(tài)特征和生理生化鑒定[7].

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)色素菌株的分離與純化

各試樣經(jīng)富集培養(yǎng)、稀釋涂布平板劃線法，篩選、分離到表面顏色為橙紅色菌落四株，分離菌株的菌落形態(tài)如圖1所示.

圖1 菌株的平板劃線分離純化

2.2 含色素提取液最大吸收波長的測(cè)定

將分離獲得的四株紅色菌株分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，提取發(fā)酵液中色素，將含有色素的丙酮提取液在紫外分光光度計(jì)中掃描，得到各菌株的最大吸收波長.菌株J1、J3、J6、J9分別在350 nm、470 nm、375 nm和340 nm處有最大吸收峰.文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)類胡蘿卜素菌株 HBUT-Y的色素丙酮提取液在465 nm～490 nm 之間有吸收強(qiáng)烈，在477 nm 處有最大吸收峰.分離菌株J3與菌株 HBUT-Y 的強(qiáng)吸收峰基本一致，由此推測(cè)：菌株J3可能為產(chǎn)類胡蘿卜素菌株.

2.3 菌株最適培養(yǎng)基的確定

從不同培養(yǎng)基下菌株的生長曲線(見圖2)可以看出：在高氏培養(yǎng)基中菌株的生長曲線很不規(guī)律，表明高氏培養(yǎng)基不適合其生長.而另三種培養(yǎng)基均適合其生長，以營養(yǎng)肉湯—無機(jī)鹽復(fù)合培養(yǎng)基為最佳，從0 h～10 h菌體處于細(xì)胞生長的延滯期，細(xì)菌代謝活躍，體積增大，為細(xì)菌的分裂增殖合成儲(chǔ)備酶、能量及中間代謝產(chǎn)物.10 h～54 h為對(duì)數(shù)生長期，54 h后為穩(wěn)定期.菌體培養(yǎng)到40 h左右即達(dá)到對(duì)數(shù)生長中期，可選用此期的細(xì)胞進(jìn)行菌株生物活性的測(cè)定等研究.

圖2 不同培養(yǎng)基下菌株J3的生長曲線

選用營養(yǎng)肉湯—無機(jī)鹽復(fù)合液體培養(yǎng)基進(jìn)行J3菌株的發(fā)酵培養(yǎng).同法提取發(fā)酵液中的紅色色素，經(jīng)測(cè)其OD470為0.774 5，胡蘿卜素產(chǎn)量約為3.873 mg/L.

2.4 目的菌株的初步鑒定

2.4.1 菌株的菌落及菌體形態(tài)特征

菌株J3菌落為橘黃色、圓形、邊緣整齊表面光亮無褶皺，直徑0.05 cm～0.1 cm.細(xì)胞為革蘭氏陽性棒桿菌，大小約1*2 um.

2.4.2 菌株J3的生理生化反應(yīng)

應(yīng)用微量發(fā)酵管，進(jìn)行J3菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1.

表1 菌株J3的生理生化反應(yīng)結(jié)果

根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和生理生化結(jié)果，對(duì)照第八版《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步確定菌株J3屬于戈登氏(gordonia)菌屬.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從植物落花土壤中篩選、分離純化出一株產(chǎn)類胡蘿卜素菌株J3，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和生理生化結(jié)果，初步確定J3菌屬于戈登氏(gordonia)菌屬微生物.該菌株無菌絲，易于液體發(fā)酵而用于生產(chǎn).但該菌株的類胡蘿卜素產(chǎn)量僅為3.873 mg/L，遠(yuǎn)低于已報(bào)道的類胡蘿卜素生產(chǎn)菌株，如光合細(xì)菌沼澤紅假單胞菌的類胡蘿卜素的產(chǎn)量可達(dá) 50.2 mg/g[8]，紅酵母的產(chǎn)量為 15 mg/L[9].今后應(yīng)通過誘變技術(shù)、采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)優(yōu)化菌株發(fā)酵工藝條件等途徑來提高該菌株的類胡蘿卜素產(chǎn)量，使其具有一定的生產(chǎn)應(yīng)用前景.

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2016-11-02

校級(jí)開放項(xiàng)目2015135，SYSKF-2016216.

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歐朝萍(1993—)，女，湖南湘平人.

R284.1

A

1009-2102(2016)04-0029-04