時(shí)榮同，張清文，姚　惠，葉小虎

(皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院藥劑科，安徽 宿州　234011)

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HPLC法測(cè)定注射用丹參多酚酸鹽中丹參乙酸鎂的含量

時(shí)榮同，張清文，姚惠，葉小虎

(皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院藥劑科，安徽 宿州234011)

摘要:目的研究合適的分離方法分離注射用丹參多酚酸鹽中丹參乙酸鎂，采用HPLC法檢測(cè)丹參乙酸鎂含量，觀察HPLC法的應(yīng)用效果。 方法采用正交試驗(yàn)進(jìn)行方法優(yōu)選。采用Zorbax-SB-C(18) (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈—四氫呋喃(26∶74)為流動(dòng)相；流速：1.0 mL·min(-1)；檢測(cè)波長：以 ELSD 檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，波長為290 nm；參數(shù)為：增益 10，氣壓 25 psi，漂移管65℃，Neb heater 60%；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。 結(jié)果丹參乙酸鎂峰面積的自然對(duì)數(shù)值與濃度的自然對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，丹參乙酸鎂的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y = -2.006X + 7.355，R2 = 0.999 3，線性范圍為59.79～597.90 mg·L(-1)；丹參乙酸鎂的平均回收率為 98.02%，RSD 為6.87%。 結(jié)論HPLC法測(cè)定注射用丹參多酚酸鹽中丹參乙酸鎂的含量操作簡(jiǎn)單，且可重復(fù)性好，可用于注射用丹參多酚酸中丹參乙酸鎂的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞:丹參多酚酸鹽；丹參乙酸鎂；HPLC法

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge)的干燥根及根莖，臨床多用于活血化瘀[1]。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，丹參具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)支功效[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)[3]，丹參中的有效成分之一的水溶性成分具有抑制血小板聚集、防治動(dòng)脈粥樣硬化、抗肝損傷抗肝纖維化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等功效。

丹參多酚酸鹽是從丹參中提取的以丹參乙酸鎂為主要成分的丹參多酚酸鹽類化合物，具有活血化瘀作用，目前臨床已應(yīng)用于冠心病的治療[4]。但丹參多酚酸鹽成分較為復(fù)雜，目前對(duì)其質(zhì)量和工藝有著諸多的研究，但如何測(cè)定丹參多酚酸鹽中各成分的含量及其對(duì)其質(zhì)量的控制存在一定的難度，也具有重要的意義[4-5]。本研究采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測(cè)丹參多酚酸鹽中丹參乙酸鎂含量，對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化，以觀察HPLC法的檢測(cè)效果?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1儀器和試藥

1.1實(shí)驗(yàn)儀器高效液相色譜儀：Agilent 1100，配Agilent 1200ELSD 檢測(cè)器，美國Agilent公司生產(chǎn)；電子天平：XP型十萬分之一電子分析天平，Mettler Toledo 公司生產(chǎn)。SPE-C18固相萃取柱，規(guī)格6 mL。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品注射用丹參多酚酸鹽，批號(hào)分別為20150912、20150920；規(guī)格：每瓶160 mg(丹參乙酸鎂)，上海綠谷制藥有限公司產(chǎn)；丹參乙酸鎂對(duì)照品，超純水。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件參數(shù)的研究和結(jié)果

2.1.1優(yōu)化后的色譜條件參數(shù)色譜柱：Zorbax-SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以乙腈—四氫呋喃(26∶74)為流動(dòng)相(為正交試驗(yàn)優(yōu)化所得)；流速：1.0 mL·min-1(為正交試驗(yàn)優(yōu)化所得)；檢測(cè)波長：290 nm。

具體參數(shù)設(shè)置為[6-7]：增益 10，氣壓 25 psi，漂移管64℃，Neb heater 60%；柱溫：25℃；進(jìn)樣量10 μL；外標(biāo)法。其中漂移管溫度為正交試驗(yàn)優(yōu)化所得。

在此條件下，丹參乙酸鎂的出峰時(shí)間tR=(23.7±0.1) min。峰型對(duì)稱良好，前后無干擾組分峰。參見圖1圖2。

2.1.2色譜條件參數(shù)的研究實(shí)驗(yàn) 正交試驗(yàn)委托安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。根據(jù)此前預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，決定重點(diǎn)篩選4個(gè)色譜條件參數(shù)(表1)，設(shè)計(jì)為4因素3水平的正交試驗(yàn)，使用L9(34)正交表，進(jìn)行優(yōu)化選擇。

正交試驗(yàn)效應(yīng)量(判斷指標(biāo))由HPLC峰高(mV)和定量準(zhǔn)確度(%)合并構(gòu)建： 效應(yīng)量=峰高(mV)×回收率(%)，判斷方向：以大為優(yōu)。

所用樣品為后述對(duì)照品溶液(No 5，0.16 g·L-1)，進(jìn)樣量為20 μL。

正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1；正交試驗(yàn)結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

按正交試驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行最后的試驗(yàn)微調(diào)，最終得優(yōu)化后的HPLC條件參數(shù)如“2.1.1”。

表1　正交試驗(yàn)因素及水平(色譜條件參數(shù))選擇

注:流動(dòng)相配比做隨機(jī)化處理。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表3　方差分析結(jié)果

注：此為飽和正交試驗(yàn)，誤差項(xiàng)實(shí)為0，且取平方和最小項(xiàng)為誤差，以提高分析靈敏度。

2.2各種實(shí)驗(yàn)溶液的配制

2.2.1供試品溶液配制用精密天平稱取干燥的注射用丹參多酚酸鹽100.0 mg，用 5.0 mL 水溶解，滴加0.1%的醋酸溶液，調(diào)整 pH 至微酸性(pH5.5～6.5)。再加至SPE-C18過濾柱頭(固相萃取小柱)，過柱并水洗。過柱液體總量為20.0 mL，收集后再加約5 倍柱體積的進(jìn)行洗脫(總約30 mL)。最后加水補(bǔ)至 100.0 mL，混勻。

2.2.2對(duì)照品溶液配制 用精密天平量取對(duì)照品丹參乙酸鎂適量，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋，制成1.0 g·L-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。再精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.20 g·L-1的對(duì)照品溶液[8]。

2.3線性關(guān)系考察分別精密量取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL置 10 mL量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻。分別取20 uL進(jìn)行進(jìn)樣，記錄峰面積A，以峰面積的自然對(duì)數(shù)值對(duì)質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)值進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)曲線所得丹參乙酸鎂的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=-2.006X+7.355，R2= 0.999 3，線性范圍為59.79～597.90 mg·L-1(按供試品取樣方法折合)。數(shù)據(jù)見表4，HPLC譜圖見圖1。

表4　標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

圖1丹參乙酸鎂對(duì)照品與注射用丹參多酚酸鹽

樣品 HPLC 色譜圖

2.4精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.1精密度精密吸取某供試品溶液按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，進(jìn)樣量 20 μL，測(cè)定丹參乙酸鎂的峰面積(mV·min-1)分別為38.96、38.94、38.63、40.05、40.72、39.14，平均(39.41±0.80)。測(cè)得丹參乙酸鎂峰面積的 RSD為2.01%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.2準(zhǔn)確度即加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取 6 份已知含量的干燥的注射用丹參多酚酸鹽，每份 50 mg，分別加入丹參乙酸鎂對(duì)照品溶液適量，然后用超純水定容至 5 mL，調(diào)整 pH 至酸性，過柱體積為20 mL，收集直接流出液和3 倍柱體積水洗液，加水補(bǔ)至75 mL，混勻，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和 RSD 值?；厥章?%)分別為94.42、93.36、107.18、104.93、98.00、90.25，平均(98.02±6.73)。即丹參乙酸鎂的平均回收率為 98.02%，RSD 為6.87%。

2.4.3穩(wěn)定性取新配制低、中、高三種不同濃度的供試品溶液，室溫靜置0、4、6、8 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果其RSD均小于6.28%，表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5樣品測(cè)定從兩個(gè)批次的注射用丹參多酚酸鹽中隨機(jī)抽出6瓶樣品(標(biāo)示量每瓶160 mg)，采用本法進(jìn)行HPLC測(cè)定，對(duì)應(yīng)的HPLC譜圖見圖2。其每瓶丹參乙酸鎂含量分別為167、164、157、145、134、134 mg，平均(150.19±14.44)mg。

圖2　6批次注射用丹參多酚酸鹽樣品的

3討論

丹參是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)中應(yīng)用最早而且最廣泛的藥物之一，有“一味丹參功同四物”的說法，由于其含多種成分，因此對(duì)每組樣品的不同測(cè)定對(duì)不同藥物的制作及準(zhǔn)確應(yīng)用有著顯著的效果[9]。

本組研究采用HPLC法檢測(cè)丹參多酚酸鹽中丹參乙酸鎂含量，觀察HPLC法的檢測(cè)效果，結(jié)果顯示：兩個(gè)批次的多份丹參多酚鹽樣品中的丹參乙酸鎂含量相對(duì)來說比較穩(wěn)定，表明：采用HPLC方法檢測(cè)簡(jiǎn)便易行，臨床可用于監(jiān)控和評(píng)價(jià)丹參多酚酸鹽的質(zhì)量。

有文獻(xiàn)介紹：由于注射用的丹參多酚鹽中的酚主要以鈉鹽形式存在，在HPLC方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，也需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)試驗(yàn)，以防多酚鹽中物質(zhì)因流動(dòng)相中的水性組分影響致其結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[10]。在本試驗(yàn)中，由于所用流動(dòng)相并不含有水，故加甲酸調(diào)節(jié)的效果未能體現(xiàn)(見正交試驗(yàn)的結(jié)果)。這是否對(duì)方法的性能及結(jié)果，例如含量為每瓶160 mg實(shí)測(cè)每瓶為(150.19±14.44)mg，存有一定的影響，有待今后的試驗(yàn)中繼續(xù)探索。

綜上所述，HPLC法測(cè)定注射用丹參多酚酸鹽中丹參乙酸鎂的含量操作簡(jiǎn)單，且重現(xiàn)性較好，可用于注射用丹參多酚酸中丹參乙酸鎂的含量測(cè)定。

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(收稿日期：2015-11-09，修回日期：2016-01-15)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.015