周紅超+陳平+張建博+左曉霜+華杰+范源

摘要：目的測定不同pH條件下的五倍子中EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）、EGC（表沒食子兒茶素）、ECG（表兒茶素沒食子酸酯）的含量變化。方法應(yīng)用反向高效液相色譜法，測定在超聲1h條件下五倍子中EGCG，EGC，ECG在不同pH的磷酸緩沖液（pH值分別為2、3、4、5、6、7、8）中的含量變化情況。結(jié)果EGCG在緩沖液pH值為2～5和6～8區(qū)間呈上升趨勢，pH值為5～6區(qū)間呈下降趨勢，且在pH值為8時含量最高；EGC在緩沖液pH值為2～4和7～8區(qū)間呈下降趨勢，pH值為4～7區(qū)間呈上升趨勢，且在pH為2時含量最高；ECG在緩沖液pH值為2～3和4～5區(qū)間呈下降趨勢，pH值為3～4和5～8區(qū)間呈上升趨勢，且在pH值為8時含量最高。結(jié)論五倍子中EGCG，EGC，ECG在不同pH值條件下的含量有變化，反映了酸堿度對五倍子中EGCG，EGC，ECG含量變化的影響，本實驗研究可為五倍子的理化性質(zhì)研究以及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等方面提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：RP-HPLC法；五倍子粉；EGCG；ECG；EGC；含量變化

中圖分類號：R284文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2016）09-0078-03

五倍子是癭綿蚜科（Pemphigidae）五節(jié)根蚜亞科（Fordinae）某些蚜蟲寄蟲癭。五倍子別名文蛤，百蟲倉，木附子等，是生在漆樹科（Anacadiaceae）鹽膚木屬（Rhus L）幾種樹的復(fù)葉上形成的一類商品，五倍子有角倍類，肚倍類，花倍類。始載于《開寶本草》，具有斂肺降火，澀腸止瀉，固精縮尿，止汗，止血，解毒，斂瘡等多種臨床功效，以它為原料的各種產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥，冶金，食品航天等領(lǐng)域[1-3]。

五倍子主要有效成分為鞣質(zhì)，又稱鞣酸。因五倍子盛產(chǎn)于我國，國際上又將五倍子鞣質(zhì)稱為中國鞣質(zhì)，它是倍酰葡萄糖的混合物，即葡萄糖上的羥基與沒食子酸所形成的酯類化臺物的混合物，屬可水解鞣質(zhì)[4]。五倍子的鞣質(zhì)含量很高，最高可達70%以上。1994年林余霖等[5]測定了7種五倍子中單寧酸的含量，角倍為4901%，肚倍為6475%圓角倍為6075%，其他幾種均在40%左右。沒食子酸也是五倍子中主要成分之一，在制藥等工業(yè)上應(yīng)用廣泛，也是藥物中間體，它的含量約占五倍子2%一4%[6]。由于含量小，工業(yè)上從五倍子獲取的沒食子酸主要通過五倍子鞣質(zhì)的水解獲得，它是我國的出口產(chǎn)品之一。五倍子中還含有五倍子油。五倍子油的主要化學(xué)成分為癸酸、月桂酸、內(nèi)豆蔻酸、棕櫚酸、硬腰酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等8種；五倍子中含有多種微量元素，包括銅、鋅、鐵、鎂、鈉、鈣等的化合物；此外，五倍子中還有樹脂、脂肪物質(zhì)、淀粉、蠟質(zhì)、蛋白質(zhì)等其他成分。

五倍子中化學(xué)成分現(xiàn)已成為研究熱點，李春遠等[7]對五倍子的石油醚和氯仿提取物做了分離，一共獲得10個化合物，分別為2-羥基-6-十五烷基苯甲酸、白果酚、棕櫚酸-1，3-二甘油酯、β-谷甾醇、正二十五烷、3-甲氧基-4-羥基-苯甲酸、棕櫚酸、月桂酸、肉豆蔻酸、沒食子酸。而五倍子中EGCG，EGC，ECG報道較少。EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯），是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體，是茶多酚生物活性的主要成份。純品為白色粉末，味苦澀、無毒、極易溶于水，能溶于甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯，不溶于氯仿。熔點218℃，在空氣中易被氧化，變成微粉色，也容易隨著溫度的升高而被氧化。EGCG中含多個酚羥基，具有很強的抗氧化和清除自由基的能力[8]。EGC（表沒食子兒茶素），別名：表沒食子酸兒茶素；綠茶兒茶酚；L-表沒食子兒茶精等。熔點208-210℃。儲存溫度2-8℃。EGC中的多酚結(jié)構(gòu)與其抗氧化或促氧化作有關(guān)[9-10]。ECG（表兒茶素沒食子酸酯）。分子式：C22H18O10。分子量44237[11-12]。純品為白色粉末。儲存溫度2-8℃。酯型兒茶素ECG具有極強的抑菌活性，可能開發(fā)成一種天然的類抗生素物質(zhì)[14]。本實驗依據(jù)EGCG，EGC，ECG的理化性質(zhì)，應(yīng)用RP-HPLC測定在不同pH條件下五倍子中EGCG，EGC，ECG的含量變化。

結(jié)構(gòu)式：

1實驗材料與儀器

11實驗藥品五倍子（角倍，購自昆明道地中藥飲片廠 規(guī)格：飲片 批號：130801）；EGCG（道斯夫生物479-560-7）；ECG（中國藥品生物制品檢定所 1257-08-05）；EGC（上海銳谷生物科技有限公司970-74-1）。

12儀器與試劑高效液相色譜儀（Agilent1200 型 VWD檢測器）；Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（46×250 mm，5 μm）。萬分之一分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司制造）；精密pH測定儀（上海雷磁 PHS-3C型）；循環(huán)水真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠 SHZ-DIII型）；高速多功能粉碎機（YB-500A型）；80目篩（5號篩180μm）；電熱恒溫干燥箱（DHG-9071A型）；超聲儀（KUDOS型）；移液管；燒杯；玻璃棒；容量瓶；微孔濾膜（045μm）；注射器（1mL）；無水甲醇（色譜純）；無水乙醇（分析純）；磷酸（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；冰醋酸（分析純）；純化水。

2實驗方法

21磷酸鹽緩沖液的配制A液：取磷酸10 mL，加純化水至100 mL，搖勻。B液：稱取磷酸氫二鈉7163 g，加純化水使溶解成100 mL。分別取上述不同體積的A 液和B液混合配制成不同pH（2、3、4、5、6、7、8）的磷酸鹽緩沖溶液，即得。

22對照品溶液的制備取EGCG標(biāo)準(zhǔn)品適量，于分析天平上精密稱定，稱得29 mg；取ECG標(biāo)準(zhǔn)品適量，于分析天平上精密稱定，稱得3 mg；取EGC標(biāo)準(zhǔn)品適量，于分析天平上精密稱定，稱得27 mg。分別置于10 mL容量瓶中，加純凈水定容至10 mL。在超聲儀中超聲溶解，通過045 μm濾膜注射至進樣瓶并編號，即得。

23供試品溶液的制備取五倍子樣品適量，敲開囊體，去除蚜蟲尸體和蚜蟲排泄物，用粉碎機粉碎，過80目篩，于電子天平上分別稱取10 g五倍子粉末7份，置于試管中并編號（2，3，4，5，6，7，8），分別加入磷酸鹽緩沖液（編號與pH值對應(yīng)）20 mL，在超聲儀中超聲1h，用045 μm微孔濾膜抽濾，用1 mL注射器吸取適量對照品溶液，通過濾膜注射至進樣瓶并編號，即得。

24色譜條件色譜條件為：Agilent C18色譜柱C18ZORBAX SB-C18柱（46×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇：水：冰醋酸（25：74：1）混合液；溫度25℃；流速：1 mL/min；波長270nm；進樣量：10 uL；時間：30 min[14]。

25標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

251EGCG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取EGCG適量于分析天平上精密稱定360 mg，加色譜甲醇溶解配制成定容至10mL，用1 mL注射器吸取適量，通過045 μm微孔濾膜注入進樣瓶，按上述EGCG色譜條件分別進樣2、4、6、8、10、12 μL，以EGCG的峰面積（Y）對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（X）進行線性回歸，得方程Y=1387X+5172，r=1，結(jié)果表明：EGCG峰面積值與濃度有良好的線性關(guān)系，線性范圍為：072μg-432 μg。

252EGC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取EGC適量于分析天平上精密稱定300 mg，加色譜甲醇溶解配制成定容至10 mL，用1 mL注射器吸取適量，通過045 μm微孔濾膜注入進樣瓶，按上述EGCG色譜條件分別進樣2、4、6、8、10、12 μL，以EGC的峰面積（Y）對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（X）進行線性回歸，得方程Y=3573X+1019，r=09991，結(jié)果表明：EGC峰面積值與濃度有良好的線性關(guān)系，線性范圍為：06 μg-36 μg。

253ECG標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取ECG適量于分析天平上精密稱定600 mg，加色譜甲醇溶解配制成定容至10 mL，用1 mL注射器吸取適量，通過045 μm微孔濾膜注入進樣瓶，按上述ECG色譜條件分別進樣2、4、6、8、10、12 μL，以EGCG的峰面積（Y）對標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（X）進行線性回歸，得方程Y=1615X-1000，r=09996，結(jié)果表明：EGCG峰面積值與濃度有良好的線性關(guān)系，線性范圍為：12 μg-72 μg。

26EGCG，EGC，ECG的含量測定分別取23項下方法制備的供試品溶液適量，按24色譜條件分別測定EGCG，EGC，ECG在不同pH的磷酸鹽緩沖液條件下的含量，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行計算。

3實驗結(jié)果與分析

31不同pH條件下EGCG，EGC，ECG 的含量變化

在緩沖液pH值為2～3的區(qū)間，隨著pH的增大，EGC含量急劇下降；pH值為3～5的區(qū)間，隨著pH的增大，EGC含量變化不明顯；pH值為5～7的區(qū)間，隨著pH的增大，EGC含量逐漸增加；pH值為7～8的區(qū)間，隨著pH的增大，EGC含量緩慢下降，且當(dāng)pH值為2時，在所測pH值范圍中含量達到最高。如圖2

在緩沖液pH為2～3的區(qū)間，隨著pH的增大，ECG含量緩慢下降；pH值為3～4的區(qū)間，隨著pH的增大，ECG含量緩慢增加；pH值為4～5的區(qū)間，隨著pH的增大，ECG含量逐漸減少；pH值為5～6的區(qū)間，隨著pH的增大，ECG含量逐漸增加，且當(dāng)pH值為8時，在所測pH值范圍中含量達到最高。如圖3

EGC在pH值為2～3的區(qū)間呈明顯下降趨勢，在pH值為2時含量最高，但酸性強則EGCg，ECG含量較低，當(dāng)pH值為7時，含量較高且酸堿度在中性；EGCG和ECG在pH值為5～8的區(qū)間呈上升趨勢，且在pH值為8時兩者含量都達所測范圍的最高，酸堿度偏中性；在pH值為6～8的區(qū)間，EGCG，EGC，ECG含量都呈上升趨勢，可能是由于偏堿、超聲條件使其提取率增加，還需要做更深一步的研究。

4結(jié)論

五倍子中EGCG，EGC，ECG報道較少。通過測定EGCG，EGC，ECG在不同pH緩沖液中的含量，結(jié)果提示：五倍子在pH值為8的緩沖液中EGCG含量最高；五倍子在pH值為2的緩沖液中EGC含量最高；五倍子在pH值為8的緩沖液中ECG含量最高。本實驗可以為五倍子進一步的理化性質(zhì)研究以及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等方面提供一定參考。參考文獻：

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