劉亞男

[摘 要]清熱解毒口服液是常見的清熱解毒藥物，藥物成分非常多，木犀草苷就是其中一種。本文應(yīng)用HPLC法來測(cè)定清熱解毒口服液中木犀草苷的含量，不僅具有非常好的回收率，而且擁有比較好的內(nèi)線性關(guān)系，還非常簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確。希望能夠?yàn)閺V大的清熱解毒口服液研究者提供借鑒。

[關(guān)鍵詞]HPLC法；清熱解毒口服液；木犀草苷；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：TU366 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2016）04-0337-01

清熱解毒口服液主要用于治療發(fā)熱面赤、咽喉腫痛等病癥。很多學(xué)者都對(duì)清熱解毒口服液中的黃芩苷等含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，但是卻很少有學(xué)者對(duì)其木犀草苷的含量進(jìn)行測(cè)定研究，基于此本文研究者選擇使用HPLC法來對(duì)清熱解毒口服液中木犀草苷的含量進(jìn)行研究。中藥藥典明確規(guī)定金銀花以及山銀花是兩個(gè)藥材，同時(shí)規(guī)定木犀草苷含量測(cè)定屬于金銀花項(xiàng)目下的一項(xiàng)測(cè)定內(nèi)容。為了保證清熱解毒口服液產(chǎn)品質(zhì)量，所選擇的制劑以及藥材必須能夠一一對(duì)應(yīng)。所使用的HPLC法測(cè)定法，方便、準(zhǔn)確，具有非常好的重現(xiàn)性，因?yàn)榭梢杂脕韺?duì)控制清熱解毒口服液的質(zhì)量。

一、儀器與試藥

戴安Ultimate3000高效液相色譜儀：紫外檢測(cè)器，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器；瑞士PrecisaXR205SM-DR電子分析天平。木犀草苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)111720-200604）；清熱解毒口服液為市售不同廠家的產(chǎn)品；水為高純水，乙腈、冰醋酸為色譜純，其余試劑均為分析純。聚酰胺，柱層析用，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠。金銀花藥材為藥材市場(chǎng)購(gòu)買，河南省食品藥品檢驗(yàn)所鑒定。

二、溶液制備

1、對(duì)照品溶液

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12h的木犀草苷對(duì)照品適量，用70%乙醇制成36.6μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2、供試品溶液

精密量取清熱解毒口服液25mL，加水25mL稀釋后全部上聚酰胺柱（玻璃柱，自行填裝，規(guī)格長(zhǎng)29cm，內(nèi)徑1.1cm），先后用水、10%乙醇、20%乙醇各200mL洗滌除雜，再用35%乙醇200mL洗滌，收集該洗脫液，水浴揮干，用甲醇溶解并定容至10mL，搖勻，即得。

3、陰性樣品溶液

取不含金銀花的處方比例藥材，按照清熱解毒口服液生產(chǎn)工藝，制備陰性樣品。按清熱解毒口服液的供試品溶液的制備方法操作，即得。

三、結(jié)果

1、色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

采用Agilent ZORBAXSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以0.2%磷酸為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫（0～30min，87%A、80%A；30～38min，80%A、63%A；38～40min，63%A；40～41min，63%A、87%A；41～60min，87%A），流速1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)350nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。以木犀草苷色譜峰計(jì)理論塔板數(shù)應(yīng)不低于2000。用上述色譜條件分別對(duì)對(duì)照品溶液和清熱解毒口服液的供試品溶液進(jìn)行分析，結(jié)果木犀草苷主峰與其他色譜峰分離良好，輔料和其他藥材不干擾測(cè)定。同時(shí)用缺金銀花的陰性樣品進(jìn)行分析，在與對(duì)照品主峰相應(yīng)的保留時(shí)間處未出現(xiàn)色譜峰，說明本法具有較強(qiáng)的專屬性。從清熱解毒口服液樣品的HPLC-PDA圖中可以看出，木犀草苷的最大吸收波長(zhǎng)為350nm，峰純度0.995，提示其為單一峰；質(zhì)譜檢測(cè)[儀器：Waters公司ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，Quattro Premier串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器。色譜條件：采用Waters公司ACQUITY UPLCTM BEHC18（2.1mm×50mm，1.7μm）色譜柱，流動(dòng)相為10mmol·L-1醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈（75∶25），流速0.13mL·min-1。質(zhì)譜條件：離子化方式，電噴霧（ESI）；離子極性，negative（-）；掃描范圍：50～1000；工作參數(shù)： Capillary（kV）3.50；Extrac-tor（V）4.00；SourceTemperature（℃）110；Desolva-tionTemperature（℃）350；ConeGasFlow（L·h-1）46；DesolvationGasFlow（L·h-1）500；GasCellPira-niPressure（Pa）0.3；

檢測(cè)方式：全掃描，結(jié)果顯示其母離子[M-1]的m/z為446.90，與木犀草苷相對(duì)分子質(zhì)量448一致，子離子[M-1]的m/z為285.10，木犀草苷脫去糖苷后的質(zhì)量數(shù)為286，與檢測(cè)到的子離子一致，說明檢測(cè)到的成分是木犀草苷。

2、線性關(guān)系考察

精密量取上述對(duì)照品溶液1，2，3，5，10μL，分別按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以木犀草苷進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為：

A=45.04C-0.078r=0.9999

3、精密度試驗(yàn)結(jié)果

研究者取相同批次溶液，之后進(jìn)行不間斷的進(jìn)樣，共6次，結(jié)果顯示木犀草苷峰面積達(dá)到了1.4%，這足以證明進(jìn)樣具有非常好的精度。

4、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

研究者首先選擇相同批次的清熱解毒口服液樣品，共量取5份，測(cè)定樣品，結(jié)果顯示這5份樣品溶液中，木犀草苷的平均含量為4.2μg.ml-1，木犀草苷峰面積達(dá)到了1.9%，這足以證明高效液相色譜法具有非常好的重現(xiàn)性。

5、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

研究者首先選擇相同批次的清熱解毒口服液樣品，共量取5份，測(cè)定樣品，測(cè)定時(shí)間分別為0h、4h、8h、12h、20h、24h，最終顯示木犀草苷峰面積達(dá)到了1.3%，這足以證明清熱解毒口服液樣品中的木犀草苷在24h保持著比較穩(wěn)定的狀態(tài)。

6、加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

精密量取已知木犀草苷含量（4.19μg·mL-1）的清熱解毒口服液樣品12.5mL，共6份，每份精密加入木犀草苷對(duì)照品溶液（36.6μg·mL-1）1mL，按上述方法制備所需溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果木犀草苷的平均回收率（n= 6）為99.8%，RSD為3.4%。

7、樣品測(cè)定結(jié)果

取不同廠家的清熱解毒口服液，按上述方法制備供試品溶液，在色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表1。

四、結(jié)論

首先，測(cè)定之前的方法選擇。因?yàn)闊峤舛究诜簶?gòu)成成分比較復(fù)雜，共有12味中草藥材，這些藥材再通過多道加工程序才獲得，成分非常復(fù)雜，因此會(huì)對(duì)HPLC法造成比較大的干擾，不能夠直接進(jìn)樣。這樣不僅會(huì)對(duì)色譜柱造成非常大的污染，也會(huì)導(dǎo)致色譜峰疊加，出現(xiàn)明顯的分離情況。研究者使用了不同種類的填料進(jìn)行除雜試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聚酰胺柱具有非常好的除雜效果。研究者不同種類的洗脫溶劑進(jìn)行了除雜試驗(yàn)研究，結(jié)果表明本文所應(yīng)用的洗脫溶劑效果的確非常好。

其次，對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行選擇。研究者取木犀草苷對(duì)照品溶液，使用紫外分光光度展開掃描，掃描范圍為200-400nm，最終波長(zhǎng)在350nm吸收效果最好。研究者又借助液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，溶液的確是在350nm處擁有最佳的吸收率。所以研究者決定將350nm看作是檢測(cè)波長(zhǎng)。

最后，流動(dòng)相的選擇。因?yàn)榍鍩峤舛究诜撼煞直容^多，也比較復(fù)雜，所以研究者選擇使用了多種流動(dòng)相系統(tǒng)以及多種梯度洗脫程序來進(jìn)行試驗(yàn)研究，結(jié)果顯示此次研究所選擇應(yīng)用的AgilentZorbaxSB C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，以0.2%磷酸（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相流動(dòng)相效果最佳，具有非常好的分離效果，分離度也達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)要求。

綜上研究可以發(fā)現(xiàn)，清熱解毒口服液生產(chǎn)廠家不同，所使用的藥材不同，生產(chǎn)過程中所使用的工藝不同，導(dǎo)致了中木犀草苷的含量的差異，為了保證中清熱解毒口服液擁有比較好質(zhì)量，可以選擇使用本文使用的測(cè)定方法。

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