羅金，劉雪麗，王雅琴，楊菁，徐望明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢　430060)

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IL-18及IL-18結(jié)合蛋白在人正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜的表達(dá)

羅金，劉雪麗，王雅琴，楊菁*，徐望明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢430060)

【摘要】目的探討白細(xì)胞介素(IL)18及IL18結(jié)合蛋白(IL18BP)在人正常月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜上的表達(dá)。方法取因子宮肌瘤或子宮脫垂行全子宮切除術(shù)的患者子宮內(nèi)膜，按月經(jīng)周期和子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果分為增生期和分泌期2組，每組10例。免疫組織化學(xué)法檢測子宮內(nèi)膜的IL-18及IL-18 BP表達(dá)；實(shí)時定量聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)檢測子宮內(nèi)膜IL-18及IL-18BP mRNA的表達(dá)。結(jié)果IL-18、IL-18BP在人增生期和分泌期子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，且隨著月經(jīng)周期其表達(dá)呈現(xiàn)時空性變化。IL18在增生期表達(dá)于腔上皮、腺上皮細(xì)胞膜及基質(zhì)細(xì)胞，與增生期相比，分泌期基質(zhì)細(xì)胞IL18的陽性表達(dá)顯著降低(MOD值0.33±0.07 vs. 0.52±0.12，P<0.05)，而IL18BP的表達(dá)則顯著增加(MOD值0.33±0.20 vs. 0.10±0.07，P<0.05)。qRT-PCR 結(jié)果顯示，在增生期和分泌期子宮內(nèi)膜標(biāo)本均有IL18和IL18BP mRNA表達(dá)，與增生期相比，分泌期IL18表達(dá)顯著下降(P<0.05)，IL18BP表達(dá)顯著增強(qiáng) (P<0.05)，IL18BP/IL18比值顯著增高(P<0.05)。結(jié)論IL18和IL18BP在整個月經(jīng)周期人子宮內(nèi)膜上均有表達(dá)，且其表達(dá)呈現(xiàn)時空性的變化，可能與月經(jīng)周期過程中子宮內(nèi)膜的崩解修復(fù)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】白細(xì)胞介素18；白細(xì)胞介素18結(jié)合蛋白；子宮內(nèi)膜；表達(dá)

(JReprodMed2016，25(3)：248-252)

子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性和胚泡與子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育是妊娠建立的關(guān)鍵因素之一，而子宮的免疫耐受機(jī)制又是影響胚泡植入的關(guān)鍵。越來越多的證據(jù)表明，胚胎著床過程中母胎界面的生長因子和細(xì)胞因子起著至關(guān)重要的作用[1]，這些細(xì)胞因子異常表達(dá)或作用的紊亂將可能引起胚胎植入失敗或異常胎盤形成[2]，而子宮內(nèi)膜則是一個產(chǎn)生細(xì)胞因子并使之活化的重要位點(diǎn)[3]。白細(xì)胞介素(IL)-18是白介素家族的一個新成員，研究表明[3-5]，人、小鼠子宮內(nèi)膜內(nèi)均有IL-18表達(dá)，胚胎植入后期鼠子宮IL-18的表達(dá)顯著高于植入前期，且妊娠期子宮IL-18的表達(dá)較非妊娠顯著增加，并隨著妊娠進(jìn)行，IL18表達(dá)逐漸增強(qiáng)，提示IL18可能對胚胎的植入、建立及維持正常妊娠具有非常重要的作用。而人IL-18結(jié)合蛋白(IL18-BP)是一種能與IL-18高親和力特異性結(jié)合的蛋白因子，它通過與IL-18競爭結(jié)合而阻止IL-18與其受體結(jié)合，從而有效地抑制IL-18的生物學(xué)活性，視為IL-18的拮抗劑[6]。本研究對人正常月經(jīng)周期不同時期子宮內(nèi)膜上IL-18和IL18-BP的表達(dá)情況進(jìn)行分析，探討其在人子宮內(nèi)膜上的表達(dá)變化規(guī)律，為進(jìn)一步探討IL-18在子宮內(nèi)膜周期變化中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

1.臨床資料：選取2014年9月至2015年3月因子宮肌瘤或子宮脫垂在本院行全子宮切除術(shù)的患者子宮內(nèi)膜共20例，根據(jù)患者月經(jīng)周期和病理檢查結(jié)果將子宮內(nèi)膜標(biāo)本分為增生期和分泌期兩組，每組10例。增生期組患者年齡32～40歲，平均年齡36.8±2.70歲，分泌期組患者年齡33～41歲，平均年齡36.5±2.72歲。所有患者既往月經(jīng)周期規(guī)律、無盆腔炎、生殖道感染和子宮內(nèi)膜異位癥及其他自身免疫性疾病等病史，近3月內(nèi)未使用激素治療。本研究獲得本院倫理委員會同意及所有患者的知情同意。

2.標(biāo)本采集：術(shù)中取新鮮子宮，刮取子宮內(nèi)膜組織，用生理鹽水漂洗干凈后，將每份子宮內(nèi)膜標(biāo)本分成兩部分，一部分迅速放入液氮中，約0.5 h后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱-70 ℃保存；另一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h后行石蠟切片。

3.試劑：Trizol購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自Fermentas公司，One Step SYBR PrimeScripTM RT-PCR Kit購自日本Takara公司，IL 18、IL18 BP引物由上海生工生物工程有限公司合成，免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，鼠抗人單克隆IL18抗體購自臺灣abnova公司，兔抗人單克隆IL18BP抗體購自英國abcam公司，二抗試劑盒購自丹麥DAKO公司。

二、方法

1.免疫組織化學(xué)檢測：(1)標(biāo)本處理：將子宮內(nèi)膜組織于4%多聚甲醛中固定24 h后，入系列乙醇脫水、透明、石蠟包埋，厚度4 μm切片。切片在溫水上展平，移至涂有10%多聚賴氨酸的玻片上，放入烤箱內(nèi)烤干，備用。(2)免疫組織化學(xué)染色：切片脫蠟至水，滴加3%過氧化氫溶液37℃封閉10 min 滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗3次后，將玻片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液的容器中微波修復(fù)，室溫下放置至自然冷卻后取出切片蒸餾水洗后，TBS緩沖液沖洗5 min×3次，蒸餾水5 min洗一次，除去TBS。每張切片滴加50 μl 10%山羊血清，37 ℃下孵育20 min，甩干。每張切片滴加約50 μl IL-18或IL18-BP一抗(稀釋倍數(shù)分別為：IL18 1∶40；IL18-BP 1∶50)，4℃過夜。TBS沖洗5 min×3次。每張切片滴加50 μl DAKO二抗(兔抗鼠)，室溫孵育20 min，TBS沖洗5 min×3次。甩去TBS，每張切片加50 μl新鮮配置的 DAKO DAB溶液鏡下觀察。流水洗15～20 min，蘇木素復(fù)染2 min，自來水沖洗后，1%鹽酸酒精分化1～2 s。自來水沖洗15 min以上，溫水返藍(lán)。切片放置梯度酒精脫水干燥，每步約2 min，二甲苯透明，中性樹膠封片鏡檢。以正常山羊血清代替一抗作為陰性對照。選取同批染色切片，每張切片在光鏡下隨機(jī)取5 個不同視野，經(jīng)Image-Pro Plus 6.0 病理圖片分析系統(tǒng)分析，測定陽性信號的光密度值(OD)。

2.實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測：(1)總RNA提?。簩⒆訉m內(nèi)膜標(biāo)本從-70 ℃冰箱中取出，研磨成粉末，加入1 ml Trizol，用力研磨成液體后移入二乙基焦炭酸酯(DEPC)水處理過的1.5 ml 微量離心管(EP)中，按照說明書裂解細(xì)胞，提取總RNA，1%瓊脂糖電泳檢測總RNA的完整性，紫外分光儀測定RNA的純度及產(chǎn)量。(2)qRT-PCR擴(kuò)增：采用One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒擴(kuò)增IL18、IL18BP的序列。引物序列及片段見表1。PCR反應(yīng)體系總體積25 μl，其中2×One Step SYBR RI-PCR Buffer 12.5 μl，Ex Taq HS 0.5 μl引物 1 μl(上下游各0.5 μl)，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ0.5 μl，Total RNA temples 2 μl，RNase Free dH2O 8.5 μl。設(shè)置反應(yīng)條件為：Pattern1：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 42℃ 5 min，95℃ 10 s；Pattern2：PCR反應(yīng)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)；收集熒光信號。每1 個樣本做 3 個平行管?；虮磉_(dá)的相對變化采用2-△△Ct法處理。

表1　各基因 real-time PCR 引物序列及片段

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、免疫組織化學(xué)法檢測IL18、IL18BP在人子宮內(nèi)膜中的表達(dá)結(jié)果

如圖1所示，IL-18、IL-18BP在人增生期和分泌期子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，IL18在增生期主要表達(dá)于腔上皮、腺上皮細(xì)胞膜及基質(zhì)細(xì)胞，分泌期則可見基質(zhì)細(xì)胞IL18表達(dá)明顯減少，IL18BP在分泌期基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增多。棕色反應(yīng)產(chǎn)物表示為抗體染色陽性反應(yīng)。采用Image-Pro Plus 6.0 病理圖片分析系統(tǒng)對IL18、IL-18BP的表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示與增生期相比，分泌期IL18的陽性表達(dá)明顯降低(MOD值0.33±0.07vs.0.52±0.12)，(P<0.05)，而IL18BP的表達(dá)則顯著增加(MOD值0.33±0.20vs. 0.10±0.07)，(P<0.05)(圖2)。

二、qRT-PCR檢測子宮內(nèi)膜中IL18、IL18BP的mRNA表達(dá)水平

qRT-PCR 結(jié)果顯示，在增生期和分泌期子宮內(nèi)膜標(biāo)本均有IL18和IL18BP mRNA表達(dá)。與增生期相比，分泌期IL18 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，IL18BP mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，IL18BP/IL18比值顯著增高(P<0.05)(圖3)。

討論

本研究中，分別從mRNA和蛋白水平檢測了IL18和IL18BP在人月經(jīng)周期不同時期子宮內(nèi)膜上的表達(dá)，結(jié)果顯示與子宮內(nèi)膜上其他的一些促炎性細(xì)胞因子如IL-1，IL-8，IL-15等表達(dá)相一致[3]，IL18和IL18BP在增生期和分泌期人子宮內(nèi)膜上均有表達(dá)。由此推測IL18信號系統(tǒng)可能與其他一些促炎性因子共同參與了人子宮內(nèi)膜免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)。

IL-18是1995年由Okamura等[7]首次分離出的一種多功能細(xì)胞因子，主要由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)與IL-l相似，功能與IL-12相似，具有多種生物學(xué)活性，最顯著的特性是對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)，尤其是THl細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)，在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中具有中心地位，對機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)有非常重要的調(diào)節(jié)作用。多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)[8-10]，Th1/Th2型細(xì)胞因子的平衡對正常妊娠的維持有著非常重要的作用，而IL-18是一個能夠根據(jù)免疫微環(huán)境變化，促進(jìn)Thl和Th2型細(xì)胞分化的細(xì)胞因子。IL18通過與其受體相結(jié)合，發(fā)揮促炎效應(yīng)[11]，而IL-18BP能夠以高親合力特異性地與IL-18相結(jié)合，抑制IL-18相關(guān)的生物學(xué)活性，如抑制IL-18誘導(dǎo)Th1等細(xì)胞產(chǎn)生干擾素(IFN-γ)、IL-8，降低IL-18對NF-κB的激活作用，以早期Thl細(xì)胞因子抑制劑的形式參與Thl應(yīng)答的調(diào)控。與IL18不同的是，IL18BP不具有種族特異性。一個健康人循環(huán)中的IL18BP濃度為(2.15±0.15) ng/ml (range 0.5～7)[12]。一般情況下，IL18BP的摩爾量是IL18的20～30倍，因此，可以認(rèn)為IL-18BP是一種與IL18升高有關(guān)的免疫或炎性疾病的有效抑制劑[3]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)在分泌期子宮內(nèi)膜基質(zhì)和腺體中IL-18 BP染色表達(dá)明顯增強(qiáng)，且與增生期相比，分泌期IL-18BP/IL-18 mRNA的比值顯著增大，結(jié)果提示人子宮內(nèi)膜分泌期 IL-18BP的表達(dá)增加可能在調(diào)節(jié)IL-18的活性過程中發(fā)揮作用。

A：增生期子宮內(nèi)膜IL18的表達(dá)；B：分泌期子宮內(nèi)膜IL18的表達(dá)；C：陽性對照，肝臟組織中IL18的表達(dá)；D：增生期子宮內(nèi)膜IL18BP的表達(dá)；E：分泌期子宮內(nèi)膜IL18BP的表達(dá)；F：陰性對照。LE：腔上皮；GE：腺上皮；S：基質(zhì)圖1　IL18及IL18BP在人子宮內(nèi)膜中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色　×200

與增生期相比較，*P<0.05A：IL-18的蛋白表達(dá)水平；B：IL18BP 的蛋白表達(dá)水平圖2　IL18及IL18BP在子宮內(nèi)膜不同時期的蛋白表達(dá)水平

與增生期相比較，*P<0.05A：IL18 mRNA相對表達(dá)量；B：IL18BP mRNA相對表達(dá)量；C：IL18BP/IL18比值圖3　子宮內(nèi)膜中IL18、IL18BP的mRNA表達(dá)情況

此外，本研究免疫組化結(jié)果顯示 IL-18和IL18-BP在人子宮內(nèi)膜上的表達(dá)隨著月經(jīng)周期呈現(xiàn)時空性變化，IL-18在增生期主要表達(dá)于腔上皮、腺上皮細(xì)胞膜及基質(zhì)細(xì)胞，分泌期則可見基質(zhì)細(xì)胞IL-18表達(dá)明顯減少，IL18-BP在分泌期基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增多。qRT-PCR結(jié)果則進(jìn)一步顯示與增生期子宮內(nèi)膜相比，分泌期子宮內(nèi)膜IL-18 mRNA表達(dá)顯著降低，而IL18-BP mRNA表達(dá)顯著增高，提示IL-18信號系統(tǒng)可能參與了人月經(jīng)周期過程中子宮內(nèi)膜的崩解與修復(fù)過程。另有研究表明[5]，IL-18是參與胚胎植入的重要細(xì)胞因子，在胎兒母體界面的特定組織中呈階段依賴性分布，在胚胎植入過程，缺乏或過度激活I(lǐng)L-18都會引起胚胎植入失敗。IL-18還可能與子宮螺旋動脈的形態(tài)變化有關(guān)，調(diào)節(jié)子宮局部血管的轉(zhuǎn)化，在胚胎成功植入過程起關(guān)鍵作用。Ledee-Bataille等[13]研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)子宮腔內(nèi)分泌物中IL-18的含量可以預(yù)測胚胎植入的成敗，IL-18陰性組患者妊娠率和胚胎著床率均顯著高于IL-18陽性組。此外，多項(xiàng)研究顯示[14-15]，自然流產(chǎn)患者血清或母胎界面IL-18表達(dá)水平較正常妊娠患者顯著升高。這些結(jié)果表明IL-18信號系統(tǒng)還可能參與了胚泡植入過程，并在妊娠過程中起著重要的作用。

綜上所述，IL-18和IL18-BP為子宮內(nèi)膜分泌的局部免疫調(diào)節(jié)因子，在整個月經(jīng)周期人子宮內(nèi)膜上均有表達(dá)，可能參與了人月經(jīng)周期過程中子宮內(nèi)膜的崩解與修復(fù)過程及胚胎著床過程中的免疫調(diào)節(jié)，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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[編輯：辛玲]

Expression of IL-18 and IL-18 binding protein in normal human endometrium during menstrual cycle

LUOJin，LIUXue-li，WANGYa-qin，YANGJing*，XUWang-ming

ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

【Abstract】

Objective： To detect the expression of IL-18 and IL-18 binding protein (IL18BP) in normal human endometrium during menstrual cycle.

Methods： A total of 20 human endometria samples were obtained from the women with normal cycle undergone hysterectomy (10/group). The endometria samples were divided to the proliferative and secretory phase group (ten for each) according the phase of cycle and morphologic examination results. The expressions of IL-18 and IL18BP were detected by immunohistochemistry and qRT-PCR respectively.

Results： IL-18 and IL-18BP were expressed in both of proliferative and secretory phase of endometrium，and the expression showed temporal changes with the menstrual cycle. IL18 mainly expressed in luminal epithelium，glandular epithelium and stromal cell membrane in the proliferative phase. Compared with the proliferative phase group，the expression of IL18 in the stromal cells was significantly reduced (MOD 0.33±0.07 vs.0.52±0.12，P<0.05)，but the expression of IL-18 BP was significantly increased in the secretory phase group (MOD 0.33±0.20 vs.0.10±0.07，P<0.05). qRT-PCR results showed that the expression of IL-18 mRNA was significantly decreased (P<0.05)，and IL-18BP was significantly increased (P<0.05) in human endometrium in secretory phase compared with proliferative phase. The ratio of IL-18BP/IL-18 was significantly increased (P<0.05).

Conclusions： IL-18 and IL-18 BP were expressed in human endometrium throughout the menstrual cycle with temporal change. They may be involved in the disintegration and repair of endometrial during the menstrual cycle.

Key words：IL18；IL18 binding protein (IL18BP)；Endometrium；Expression

【作者簡介】羅金，女，湖北天門人，博士，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*通訊作者,Email：dryangqing@hotmail.com)

【基金項(xiàng)目】中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(No：2042015kf0137)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.3.010

【投稿日期】2015-09-01；【修回日期】2015-11-11