曹斌斌，武 娟，許川山，梁榮能，李兆杰　，王玉明，薛 勇，薛長(zhǎng)湖，唐慶娟,*（.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 66003；.香港中文大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，香港 999077）

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姜黃素介導(dǎo)的光動(dòng)力冷殺菌方法對(duì)牡蠣殺菌的效果研究

曹斌斌1，武 娟1，許川山2，梁榮能2，李兆杰1，王玉明1，薛 勇1，薛長(zhǎng)湖1，唐慶娟1,*
（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.香港中文大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，香港 999077）

摘 要：通過(guò)光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT）對(duì)牡蠣肉勻漿及牡蠣腸道中的細(xì)菌進(jìn)行殺滅處理，探究PDT可否殺滅牡蠣中的細(xì)菌。結(jié)果表明，以姜黃素為光敏劑的光動(dòng)力冷殺菌處理對(duì)牡蠣中細(xì)菌具有非常好的滅活效果，3、6 h光敏劑富集組對(duì)牡蠣的殺菌率可達(dá)90%以上。同時(shí)該方法處理簡(jiǎn)便，且具有廣譜殺菌特性。

關(guān)鍵詞：光動(dòng)力方法；冷殺菌；牡蠣；姜黃素；菌落總數(shù)

引文格式：

曹斌斌,武娟,許川山,等.姜黃素介導(dǎo)的光動(dòng)力冷殺菌方法對(duì)牡蠣殺菌的效果研究[J].食品科學(xué),2016,37(5):46-49.

CAO Binbin,WU Juan,XU Chuanshan,et al.Inactivation effect of curcumin-mediated photodynamic non-thermal sterilization on bacteria in oysters[J].Food Science,2016,37(5):46-49.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605009.http://www.spkx.net.cn

我國(guó)牡蠣多為近海養(yǎng)殖，水體極易被污染，牡蠣在濾食水中食物的同時(shí)大量富集養(yǎng)殖水域中各類微生物，導(dǎo)致牡蠣衛(wèi)生質(zhì)量較差、貨架期較短，容易引發(fā)食品安全問(wèn)題[1]。傳統(tǒng)的熱力殺菌方法雖然可以有效滅活微生物，但所需的高溫會(huì)導(dǎo)致食品產(chǎn)生色澤、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的改變和損失[2]，導(dǎo)致加工后的牡蠣難以滿足消費(fèi)者生食貝類的飲食要求。所以，各類冷殺菌方法常被用于牡蠣加工保鮮中，目前已應(yīng)用的冷殺菌技術(shù)主要有涂膜保鮮[3-5]、凍藏保鮮[6-7]、臭氧殺菌保鮮[8]、超高壓殺菌保鮮[9]等技術(shù)。但是，這些技術(shù)或殺菌效果不理想，或?qū)е履迪牋I(yíng)養(yǎng)丟失嚴(yán)重，或成本太高。因此，開(kāi)發(fā)一種能有效滅活微生物又能保持牡蠣的營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì)，成本低廉的新型冷殺菌技術(shù)是牡蠣加工行業(yè)迫切的要求[10]。

光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT）亦稱光化學(xué)療法或光輻射療法（photodynamic inactivation，PDI），是一種可選擇性滅活惡性腫瘤細(xì)胞和致病性微生物（包括細(xì)菌、真菌和病毒）的新方法。在特定波長(zhǎng)的光源照射激發(fā)下，無(wú)毒的光敏劑吸收光子的能量后躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的光敏劑將能量傳遞給周圍的氧，產(chǎn)生單態(tài)氧和一些活性氧物質(zhì)。這些活性氧具有強(qiáng)氧化作用，能夠破壞細(xì)胞大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞受損乃至死亡，從而達(dá)到滅活惡性腫瘤細(xì)胞和致病微生物的目的[11-13]。目前，光動(dòng)力療法已經(jīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤[14-15]、抗細(xì)菌[16]、抗病毒[17]等效果，被應(yīng)用于癌癥[18]及血液制品[19]的消毒中，但是尚未見(jiàn)該技術(shù)在水產(chǎn)品加工領(lǐng)域應(yīng)用的報(bào)道。

姜黃素是目前世界上銷量最大的天然食用色素之一，屬于天然植物提取物，原料來(lái)源廣，成本低，安全無(wú)毒、無(wú)污染。研究表明，姜黃素具有光敏活性，對(duì)紅色毛癬菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等有強(qiáng)烈的抑制作用，可以治療皮膚病[20-23]。江園等[12,22]報(bào)道以姜黃素為光敏劑的光動(dòng)力方法可以有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并且具有較好的殺菌效果，其中激發(fā)光為普通藍(lán)光光源（波長(zhǎng)范圍420～480 nm）。本實(shí)驗(yàn)采用姜黃素為光敏劑的光動(dòng)力方法處理牡蠣，探討該方法對(duì)牡蠣中細(xì)菌的滅活效果，為光動(dòng)力殺菌法應(yīng)用于水產(chǎn)品加工領(lǐng)域提供參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

牡蠣購(gòu)買于青島市團(tuán)島農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，鮮活低溫條件運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，無(wú)菌水沖洗干凈備用。

姜黃素（curcumin，食品級(jí)，純度＞95%） 陜西慈緣生物科技有限公司；LB瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JYL-C012九陽(yáng)料理機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；LED藍(lán)光光源（波長(zhǎng)范圍420～480 nm）由香港中文大學(xué)許川山課題組提供。

1.2方法

1.2.1光動(dòng)力對(duì)牡蠣腸道細(xì)菌的滅活

將新鮮的牡蠣洗干凈后在無(wú)菌條件下開(kāi)殼，切取牡蠣消化道部分，用無(wú)菌水稀釋100 倍后勻漿。在無(wú)菌的6孔板各孔中加入2 mL勻漿液，按照處理?xiàng)l件不同將勻漿液分成4 組，分別為：對(duì)照組（無(wú)光照、無(wú)姜黃素）、單純光照組（有光照、無(wú)姜黃素，使用自制光源照射60 s，根據(jù)光源功率推算得到光能量密度為3.6 J/cm2，后文中均使用光能量密度來(lái)描述光照強(qiáng)度）、單純光敏劑組（添加10 μmol/L的姜黃素，避光）、光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)組（添加10 μmol/L姜黃素，光能量密度為3.6 J/cm2）。每組設(shè)置2 個(gè)平行。無(wú)菌條件下，參照GB 4789.3—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》要求，分別取勻漿液1 mL接種到LB固體培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)細(xì)菌總數(shù)。其中，殺菌率按下式計(jì)算。

1.2.2光動(dòng)力冷殺菌技術(shù)條件的選取

本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)影響光動(dòng)力方法對(duì)牡蠣肉殺菌效果的主要因素是光能量密度和光敏劑濃度。在此基礎(chǔ)上，按照1.2.1節(jié)所述步驟處理牡蠣，獲得其消化道部分的勻漿稀釋液，以此來(lái)探究不同姜黃素濃度（0.1、1.0、10.0 μmol/L）和光能量密度（1.8、3.6、5.4 J/cm2）對(duì)殺菌效果的影響。

1.2.3光動(dòng)力對(duì)新鮮半殼牡蠣中細(xì)菌的滅活

將新鮮、洗凈的活牡蠣分成4 組，對(duì)照組置于人工海水中，其余3 組置于含有姜黃素10 μmol/L的人工海水中，分別暫養(yǎng)3、6、12 h，其中m（貝類）∶m（海水）= 1∶4。將富集了姜黃素的牡蠣在無(wú)菌條件下開(kāi)殼，給予5.4 J/cm2的光能量密度。各組取適量實(shí)驗(yàn)前后的姜黃素人工海水，用720型分光光度計(jì)測(cè)定446 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值，計(jì)算姜黃素的富集量，暫養(yǎng)3、6、12 h后姜黃素富集量按下式計(jì)算。

在無(wú)菌條件下，將4 組牡蠣肉進(jìn)行勻漿并分別以體積比1∶100添加無(wú)菌水，將稀釋液涂布到LB固體培養(yǎng)基上，設(shè)置陰性對(duì)照為無(wú)菌水，涂布后培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。每組進(jìn)行3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4牡蠣中細(xì)菌的純化培養(yǎng)和16S rRNA基因測(cè)序

為了驗(yàn)證光動(dòng)力殺菌方法是否在牡蠣殺菌中也具有非特異性殺菌特性，挑取對(duì)照組培養(yǎng)基中生長(zhǎng)但光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中已被殺滅或數(shù)量大量減少的細(xì)菌菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基后，置于25 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取菌液在LB固體培養(yǎng)基表面進(jìn)行劃線培養(yǎng)，挑取單菌落后在LB肉湯液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大化培養(yǎng)，取5 mL菌液在4 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液得菌體，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA測(cè)序。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA）；顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1光動(dòng)力對(duì)牡蠣腸道細(xì)菌的滅活效果

由圖1可知，單純光照組與對(duì)照組菌落數(shù)沒(méi)有顯著變化；由于姜黃素本身就具有一定的殺菌活性，所以只添加光敏劑具有一定的殺菌效果，殺菌率為44.27%，與對(duì)照組相比差異極顯著；光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)組中殺菌率達(dá)到98.85%，與對(duì)照組相比差異極顯著。由此，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，光動(dòng)力方法對(duì)牡蠣腸道細(xì)菌具有較好的殺菌效果。

圖1　光動(dòng)力對(duì)牡蠣腸道細(xì)菌滅活效果Fig.1 Inactivation of PDT on intestinal bacteria in oysters

2.2光動(dòng)力冷殺菌條件選取

圖2　不同姜黃素濃度和光能量密度對(duì)殺菌效果的影響Fig.2 Effect of different concentrations of curcumin and different light energy densities on sterilization efficiency

由圖2可知，在光能量密度為1.8 J/cm2時(shí)，低光敏劑濃度的實(shí)驗(yàn)組殺菌效果不佳，2 個(gè)高光敏劑濃度的實(shí)驗(yàn)組殺菌效果較好且無(wú)明顯差異（P＞0.05）；在光能量密度為3.6 J/cm2和5.4 J/cm2時(shí)，光敏劑濃度為10 μmol/L實(shí)驗(yàn)組殺菌效果極好，且相比于其他2 個(gè)光敏劑組均具有明顯差異（P＜0.01），而光敏劑濃度為1.0、0.1 μmol/L時(shí)殺菌效果不佳。所以，當(dāng)光敏劑濃度為10 μmol/L、光能量密度為3.6～5.4 J/cm2時(shí)，光動(dòng)力方法可以有效殺滅牡蠣勻漿中細(xì)菌。為了節(jié)約能源，本課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均設(shè)置光能量密度為3.6 J/cm2。

2.3光動(dòng)力對(duì)新鮮半殼牡蠣中細(xì)菌的滅活效果

表1　姜黃素富集時(shí)間對(duì)新鮮半殼牡蠣中細(xì)菌的殺菌效果Table 1 Sterilization of different bioaccumulation time of curcumin on bacteria in half-shell oysters

將光敏劑按照不同富集時(shí)間進(jìn)行分組，分為0、3、6、12 h共4 組。由表1可知，在3、6 h后光敏劑基本被完全富集，12 h長(zhǎng)時(shí)間富集后光敏劑富集水平基本無(wú)變化，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；相比于0 h光敏劑富集組，3、6 h光敏劑富集組對(duì)牡蠣殺菌率均為90%以上，差異極顯著（P＜0.01）；然而，12 h富集組的殺菌率僅為56.31%，相比于0 h光敏劑富集組，仍具有極顯著差異（P＜0.01），推測(cè)12 h組殺菌率低的原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的富集過(guò)程中光敏劑降解，并伴有細(xì)菌增殖過(guò)程，確切原因有待進(jìn)一步探究。

2.4光動(dòng)力冷殺菌技術(shù)對(duì)牡蠣中特定細(xì)菌的抑制效果

在探究光動(dòng)力方法對(duì)牡蠣中細(xì)菌滅活效果實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)觀察各組培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中圓形菌落相比對(duì)照組數(shù)量減少，而一些黃色菌落、橙色菌落均完全消失。因此挑取這些具有明顯形態(tài)差異的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因后進(jìn)行測(cè)序，以鑒別這些菌落種屬，驗(yàn)證光動(dòng)力殺菌在牡蠣殺菌中是否具有非特異性。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，得到菌落在國(guó)家國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中的基因序號(hào)，其結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，嗜冷桿菌滅活效果較好但是仍有菌落檢出；迪茨氏菌、枯草芽孢桿菌未檢出。這3 類菌落既有革蘭氏陰性菌又有革蘭氏陽(yáng)性菌，其中嗜冷桿菌并不屬于致病菌，并且本課題組也已驗(yàn)證光動(dòng)力方法對(duì)牡蠣中的大腸桿菌和副溶血性弧菌也具有較好的殺滅效果，這都說(shuō)明光動(dòng)力方法可以廣泛地殺滅牡蠣體內(nèi)細(xì)菌，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

表2　光動(dòng)力冷殺菌技術(shù)對(duì)牡蠣中特定細(xì)菌抑制效果Table 2 Photodynamic sterilization of particular bacteria in oysters

3　討 論

目前，常用于牡蠣保藏的熱力學(xué)殺菌方法、凍藏方法，對(duì)牡蠣風(fēng)味及解凍后品質(zhì)影響較大，市場(chǎng)亟需尋找能最大限度地保留牡蠣色、香、味及營(yíng)養(yǎng)成分的新型保鮮冷殺菌方法?，F(xiàn)已應(yīng)用于牡蠣保鮮殺菌的冷殺菌技術(shù)存在諸多問(wèn)題：涂膜保鮮技術(shù)殺菌效果不佳；保鮮劑結(jié)合微凍保鮮等方法易引起牡蠣汁液流失；凍藏保鮮可延長(zhǎng)保質(zhì)期，但是容易造成牡蠣組織結(jié)構(gòu)的破壞、脂肪氧化、色澤變化，解凍后營(yíng)養(yǎng)流失嚴(yán)重；氣調(diào)保鮮效果不佳，基本無(wú)殺菌效果；臭氧保鮮殺菌技術(shù)中臭氧的制備和存儲(chǔ)復(fù)雜，生產(chǎn)成本高；超高壓處理保鮮對(duì)牡蠣的品質(zhì)影響很小，能保持牡蠣原有的味道，但是設(shè)備昂貴、生產(chǎn)成本高[24]。

光動(dòng)力療法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于皮膚病等疾病的治療，也已被證明可以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞、細(xì)菌等都有較好的滅活或抑制效果，但暫無(wú)應(yīng)用于水產(chǎn)品加工的報(bào)道[25-28]。本研究成功地將光動(dòng)力方法用于牡蠣中細(xì)菌的滅活，取得了較好的效果，證實(shí)了以姜黃素為光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力冷殺菌方法可以有效滅活牡蠣腸道及牡蠣體內(nèi)的細(xì)菌，其殺菌率達(dá)到90%以上，其中嗜冷桿菌、速生嗜冷桿菌被部分滅活，迪茨氏菌、枯草芽孢桿菌被完全滅活。光動(dòng)力殺菌方法屬于冷殺菌，整個(gè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，極好地保持了牡蠣的感官品質(zhì)，可以滿足消費(fèi)者生食牡蠣的需求，具有很高的推廣應(yīng)用價(jià)值。

光動(dòng)力冷殺菌方法相比于目前已有的各類牡蠣殺菌方法，具有低成本、安全、簡(jiǎn)便、無(wú)毒無(wú)害、非特異性殺菌等一系列優(yōu)點(diǎn)，并且經(jīng)過(guò)7 名專業(yè)感官評(píng)定小組成員評(píng)定后（實(shí)驗(yàn)結(jié)果略），處理后牡蠣的感官品質(zhì)得到了很好的保持。光動(dòng)力殺菌處理有效地殺滅了牡蠣中細(xì)菌，且經(jīng)處理的牡蠣能在外觀和口感上保持原有品質(zhì)，十分契合消費(fèi)者對(duì)牡蠣生食的飲食需求，是一種很好的牡蠣冷殺菌方法。

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Inactivation Effect of Curcumin-Mediated Photodynamic Non-Thermal Sterilization on Bacteria in Oysters

CAO Binbin1,WU Juan1,XU Chuanshan2,LEUNG Albert Wing nang2,LI Zhaojie1,WANG Yuming1,XUE Yong1,XUE Changhu1,TANG Qingjuan1,*
(1.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China; 2.School of Chinese Medicine,The Chinese University of Hong Kong,Hong Kong 999077,China)

Abstract:This study aims to explore whether photodynamic therapy(PDT)can inactivate bacteria in oysters.The results showed that photodynamic inactivation technology using curcumin as the photosensitizer had very good inactivation effect on bacteria in oysters.This technology has the characteristics of high sterilization efficiency(exceeding 90%),broad antibacterial spectrum,and easy operation.This study suggests that photodynamic non-thermal sterilization technology has the potential to be applied in the oyster processing industry in the future.

Key words:photodynamic method; non-thermal sterilization; oyster; curcumin; total plate count

中圖分類號(hào)：TS254.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）05-0046-04

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605009 10.7506/spkx1002-6630-201605009.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：唐慶娟（1971—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：tangqingjuan@ouc.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：曹斌斌（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：cbbhaida@163.com

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF115030）；“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項(xiàng)

收稿日期：2015-04-08