張志燕，馬海樂，楊艷華（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 1013；.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 1013）

?

蛋白質(zhì)組學(xué)及其在醋酸菌研究中的應(yīng)用

張志燕1,2，馬海樂1,*，楊艷華2
（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

摘 要：蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是后基因組學(xué)時(shí)代的重要研究手段。近年來，在食品工業(yè)微生物領(lǐng)域，其中在對食醋生產(chǎn)中起主要作用的醋酸菌研究中，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已得到了廣泛應(yīng)用。本文簡述了蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及研究的主要技術(shù)，同時(shí)綜述了蛋白質(zhì)組學(xué)在醋酸菌研究中的應(yīng)用，展望了醋酸菌蛋白質(zhì)組學(xué)在食醋工業(yè)中的應(yīng)用發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組；醋酸菌；二維凝膠電泳；質(zhì)譜技術(shù)

引文格式：

張志燕,馬海樂,楊艷華.蛋白質(zhì)組學(xué)及其在醋酸菌研究中的應(yīng)用[J].食品科學(xué),2016,37(5):259-264.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605045.http://www.spkx.net.cn

ZHANG Zhiyan,MA Haile,YANG Yanhua.Advances in proteomics and its application in acetic acid bacteria research[J].Food Science,2016,37(5):259-264.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605045.http://www.spkx.net.cn

隨著人類基因組測序工作的完成，生命科學(xué)研究已進(jìn)入后基因組學(xué)時(shí)代，蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）作為后基因組時(shí)代研究的主要內(nèi)容，已經(jīng)成為國際上研究的前沿和熱點(diǎn)。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，借助二維電泳等技術(shù)和生物信息學(xué)工具，能夠鑒定大量功能蛋白，并挖掘新的功能未知蛋白，這對了解蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)互作機(jī)制、開發(fā)具有應(yīng)用潛力的新菌種等具有極其重要的意義。由于二維電泳技術(shù)的日趨完善及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)迅猛發(fā)展，并被越來越多地應(yīng)用于包括食品微生物在內(nèi)的工業(yè)微生物研究領(lǐng)域中，如乳酸菌、芽孢桿菌、釀酒酵母等微生物的蛋白質(zhì)組研究均取得了較大進(jìn)展[1-3]。醋酸菌是嚴(yán)格好氧的革蘭氏陰性菌，具有氧化酒精為醋酸的能力，廣泛應(yīng)用于食品、飲料等工業(yè)上，在食醋工業(yè)生產(chǎn)上尤為重要，是醋酸發(fā)酵過程中的關(guān)鍵菌株。

1　蛋白質(zhì)組學(xué)

“蛋白質(zhì)組（proteome）”一詞最早由Marc Wilkins 于1994年在意大利錫耶納（Siena）舉辦的一次雙向電泳（two dimensional electrophoresis，2-DE）會議上提出，1995年首次在文獻(xiàn)中公開使用“proteome”一詞，它是指一個基因組、一種生物或一種細(xì)胞/組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)[4]。蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組作為研究對象，大規(guī)模、系統(tǒng)地對蛋白質(zhì)的特性、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，具體包括蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)（成熟、翻譯后修飾等）、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、互作網(wǎng)絡(luò)（蛋白質(zhì)之間的相互作用）、功能、調(diào)控和轉(zhuǎn)運(yùn)等，進(jìn)而對其組成以及調(diào)控的生命規(guī)律進(jìn)行整體水平上的研究，對生物體生命活動的本質(zhì)進(jìn)行全面地揭示[5]。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容主要有兩個方面，即表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)。表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)（expression proteomics）又稱組成蛋白質(zhì)組學(xué)（constitution proteomics），主要對蛋白質(zhì)組表達(dá)模式進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組學(xué)的本質(zhì)就是大規(guī)模的、系統(tǒng)性的研究蛋白質(zhì)組，即采用高通量的蛋白質(zhì)分離、鑒定技術(shù)以檢測特定條件下某一細(xì)胞或組織中的所有蛋白質(zhì)，并構(gòu)建蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。功能蛋白質(zhì)組學(xué)（functional proteomics）又稱比較蛋白質(zhì)組學(xué)（comparative proteomics），是對蛋白質(zhì)組功能模式的研究，著重于通過比較2個或多個樣本之間的差異蛋白質(zhì)譜，來尋找、篩選導(dǎo)致差異蛋白質(zhì)譜產(chǎn)生的因素，即研究不同時(shí)期、不同環(huán)境下蛋白質(zhì)組成的變化。通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可挖掘蛋白質(zhì)間相互作用與協(xié)調(diào)關(guān)系，并可進(jìn)一步鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)性。在建立蛋白質(zhì)相互作用圖譜的基礎(chǔ)上，人們可進(jìn)一步通過阻斷蛋白質(zhì)相互作用研究細(xì)胞的功能[6]。功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究更傾向于把蛋白質(zhì)組學(xué)作為研究生命現(xiàn)象的手段和方法。

2　蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法

2.1蛋白質(zhì)樣品的制備

蛋白質(zhì)組研究的第一步是制備蛋白質(zhì)樣品，這也是最關(guān)鍵的步驟之一。樣品制備的好壞直接決定能否成功獲得清晰的二維凝膠電泳圖譜。制備樣品時(shí)需遵循以下原則：制備方法簡單，具有可重復(fù)性；裂解細(xì)胞或組織的方法應(yīng)減少蛋白質(zhì)降解與修飾；避免反復(fù)凍融樣品；盡量去除樣品中非蛋白雜質(zhì)和干擾蛋白；在樣品溶液中加入尿素后，加熱溫度不超過37 ℃，防止蛋白質(zhì)氨甲?；揎椂鸬鞍踪|(zhì)pI值的偏移；提高樣品的溶解度[7]。尿素和硫脲是常用的變性劑，通過破壞氫鍵使蛋白質(zhì)更加伸展，完全暴露蛋白疏水中心，使樣品蛋白質(zhì)易于溶解。表面活性劑如去污劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Triton X-100和NP-40、3-（3-（膽酰胺丙級）二甲氨基）丙磺酸內(nèi)鹽（3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonio)propanesulfonate，CHAPS）等，用來保證蛋白質(zhì)完全溶解，防止經(jīng)變性劑處理而暴露的蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)間相互作用而聚集。還原劑如二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），有抗氧化作用，使蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的二硫鍵解離，使蛋白質(zhì)完全處于還原狀態(tài)。

2.2蛋白質(zhì)樣品的分離

從蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)來看，當(dāng)前蛋白質(zhì)樣品的分離方法主要有兩大類：一類是基于傳統(tǒng)的二維凝膠電泳分離技術(shù)；另一類是將混合蛋白樣品酶解，經(jīng)過合適的色譜分離技術(shù)進(jìn)行分離。

2.2.1二維凝膠電泳

2-DE技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的分離技術(shù)，尤其是在比較蛋白質(zhì)組學(xué)中。2-DE是指蛋白質(zhì)樣品經(jīng)等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（poly-acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行二次分離，其原理是根據(jù)等電點(diǎn)和分子質(zhì)量的不同對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。2-DE技術(shù)通量高，可同時(shí)分離檢測3 000～5 000 個蛋白質(zhì)（甚至10 000 個）；此外，該技術(shù)分辨率也較高，固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）膠條能夠分辨等電點(diǎn)相差為0.01的不同蛋白。隨著技術(shù)的改進(jìn)和生物質(zhì)譜技術(shù)靈敏度的提高，2-DE技術(shù)的應(yīng)用更為廣泛。然而，2-DE仍面臨許多技術(shù)瓶頸，該技術(shù)對疏水性、極酸或極堿性、極高或極低分子質(zhì)量以及低豐度蛋白質(zhì)的分離較為困難；小規(guī)模和自動化程度低的蛋白質(zhì)分離，也使得利用2-DE難以獲得高分辨率、高重復(fù)性的二維圖譜；此外，2-DE操作相對費(fèi)時(shí)、費(fèi)力[8]。

2.2.2二維熒光差異凝膠電泳

為了解決2-DE存在的缺陷，1997年Unlu等[9]首次提出了二維熒光差異凝膠電泳（two dimension fluorescence difference gel eleltrophoresis，2D-DIGE）。隨后，Amersham公司把DIGE技術(shù)作為公司的核心蛋白質(zhì)組技術(shù)，不斷地探索開發(fā)，使DIGE成為更加優(yōu)化的技術(shù)并將其市場化[10]。2D-DIGE是一種基于熒光標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，利用多重?zé)晒夥治?，同時(shí)在一塊凝膠上進(jìn)行電泳，實(shí)現(xiàn)2 種以上樣品的分離和比較分析，目前主要用于比較蛋白質(zhì)組的研究[11]。2D-DIGE技術(shù)比傳統(tǒng)的2-DE技術(shù)具有更高的靈敏性和動力學(xué)范圍，且不需要在電泳后進(jìn)行固定或脫色過程，從而減少了蛋白質(zhì)特別是低豐度蛋白質(zhì)的損失[12]。雖然2D-DIGE技術(shù)發(fā)展積累的時(shí)間不長，但2D-DIGE技術(shù)具有快速、精確、可重復(fù)、實(shí)驗(yàn)誤差小等特點(diǎn)，因此近幾年在生物學(xué)各個領(lǐng)域（微生物、植物、動物等）得到了廣泛的應(yīng)用[13-15]。然而較難分離檢測極端分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)極酸或極堿性的蛋白質(zhì)，特別是昂貴的價(jià)格，是2D-DIGE技術(shù)仍將面臨的挑戰(zhàn)。

2.2.3多維色譜技術(shù)

對于復(fù)雜的蛋白質(zhì)組樣品而言，特別是具有極端分子質(zhì)量或pH值、具有磷酸化蛋白或糖蛋白的蛋白樣品，2-DE不能滿足分離要求，多維色譜分離系統(tǒng)則在技術(shù)上彌補(bǔ)了二維的不足。多維色譜技術(shù)（multidimensionalchromatography，MDC）是2 種或2 種以上具有不同分離原理特性的液相分離方法的優(yōu)化和組合，根據(jù)Giddings[16]的理論，該技術(shù)通過減少峰重疊，有效提高了系統(tǒng)對樣本的分辨率和峰容量，為樣品提供更多的數(shù)據(jù)信息。MDC的基本原理是按照樣品中各個組分性質(zhì)（分子質(zhì)量、分子大小、疏水性、等電點(diǎn)等）的差異進(jìn)行組合分離。多維色譜的組合必須滿足兩個條件：1）各維色譜的分離機(jī)制應(yīng)完全不同；2）高維分離速率大于低維[17]。由于多維色譜分離速度快、重現(xiàn)性好、自動化程度高，是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中主要應(yīng)用的色譜分離方法[18-20]。目前常用的MDC系統(tǒng)有二維離子交換-反相分離系統(tǒng)（two-dimensional cation exchange and reverse-phase liquid chromatography，2D-SCX-RPLC）、二維親水作用-反相分離系統(tǒng)（two-dimensional hydrophilic interaction liquid chromatography and reverse-phase liquid chromatography system，2D-HILIC-RPLC）、二維反向-反向分離系統(tǒng)（two-dimensional reverse-phase liquid chromatography，2D-RPLC-RPLC）、多維體積排阻-反相分離系統(tǒng)（multidimensional size exclusion chromatography and reversephase liquid chromatography，多維SEC-RPLC）等。

2.3蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)譜鑒定

蛋白質(zhì)樣品的鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心任務(wù)。鑒定蛋白質(zhì)的方法很多，其中質(zhì)譜技術(shù)（mass spectrometry，MS）因其高通量、高靈敏度、精確性強(qiáng)等特點(diǎn)，已經(jīng)逐步取代了傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定方法，如Edman降解法、氨基酸分析法等[21]。MS的基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定分子質(zhì)量。MS鑒定主要有兩種方法：一種是基于肽質(zhì)量指紋圖譜（peptide mass fi nger printing，PMF）鑒定蛋白質(zhì)，該技術(shù)適用于已知全基因組序列的物種；另一種是基于多級質(zhì)譜的蛋白質(zhì)鑒定。

2.3.1基于肽質(zhì)量指紋圖譜

PMF是指蛋白質(zhì)被特異性酶解后產(chǎn)生特定的肽段序列，通過質(zhì)譜對肽段混合物進(jìn)行質(zhì)量分析，再結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定：如基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）或電噴霧電離質(zhì)譜（electro spray ionization-mass spectroscopy，ESI-MS）。MALDI和ESI是在蛋白質(zhì)組學(xué)中使用最廣泛的電離方法[22]。由于每個蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸序列，因此不同的蛋白質(zhì)所得肽段序列具有指紋特征。將實(shí)驗(yàn)獲得的PMF與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中理論的PMF比較，即可鑒定出蛋白質(zhì)。

PMF技術(shù)是一種高效快速的鑒定蛋白質(zhì)的方法，特別是應(yīng)用于自動化的MALDI-TOF/MS中，但是它也存在一些不足。PMF技術(shù)受樣品的總量、純度、蛋白修飾方式以及數(shù)據(jù)庫完善程度等方面限制，所以一般需要與其他方法結(jié)合使用才能達(dá)到分析目的。

2.3.2基于多級質(zhì)譜

多級質(zhì)譜（MS/MS）是一種被廣泛使用可代替PMF的方法。由MS/MS產(chǎn)生的來自于肽段序列中連續(xù)氨基酸的一系列碎片離子，可以作為一個肽段的指紋印跡，用這個方法不需要檢測出蛋白質(zhì)中的每一段多肽序列，只需要鑒定蛋白質(zhì)2 個或2 個以上的肽段就足以鑒定該種蛋白質(zhì)。這種方法使得搜索鑒定未完成基因組測序的蛋白質(zhì)成為可能，也可以分析來自更復(fù)雜混合物的蛋白質(zhì)[23]。MS/MS鑒定已經(jīng)成為一種功能強(qiáng)大且穩(wěn)定的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)，為蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了必要的技術(shù)手段[24-26]。多級質(zhì)譜的代表方法有高效液相色譜/電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-electrospray ionisationtandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）、二維高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜連用（two-dimensional-liquid chromatographytandem mass spectrometry，2D-LC-MS/MS）。

肽段碎片指紋圖譜（peptide fragment fi ngerprinting，PFF）是用特異性的酶酶解蛋白質(zhì)，經(jīng)分離得到的肽段在質(zhì)譜中被選擇及破碎后得到的MS/MS譜圖，與來自于蛋白質(zhì)理論酶解產(chǎn)物的MS/MS譜圖相關(guān)聯(lián)，得出與理論譜圖匹配最好的肽段序列，作為待分析的肽段進(jìn)行鑒定。PFF技術(shù)精度高、分析時(shí)間短、可同時(shí)處理多個樣品。不足之處是肽段中氨基酸殘基單元的質(zhì)譜學(xué)特性目前仍不清楚。

2.4蛋白質(zhì)樣品的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)（bioinformatics）是伴隨著生命科學(xué)的研究，以計(jì)算機(jī)為工具對生物信息進(jìn)行收集、整理、儲存、檢索和分析的一門新興交叉學(xué)科[6]。生物信息學(xué)由三部分組成，分別是計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)、數(shù)據(jù)庫和應(yīng)用軟件[27]。應(yīng)用生物信息學(xué)可以發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)相關(guān)的功能信息，包括預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能、基因及其同源體的識別、蛋白質(zhì)在某一特定通路中的定位及其功能。蛋白質(zhì)組信息學(xué)研究內(nèi)容主要有以下幾個方面：蛋白質(zhì)序列比較分析；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測；蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及作用途徑的研究。目前常用的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫有：1）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，如SwissPort、NCBInr、PIR、EMBL等；2）蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，如PDB、SCOP、CATH等；3）蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫，如GO、GOG、KEGG等。

2.5蛋白質(zhì)組學(xué)存在的問題

盡管蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)展迅速并逐漸成熟，但是仍存在一些問題需要解決：1）不能分離和檢測到蛋白質(zhì)組中所有的蛋白質(zhì)，尤其是低豐度蛋白質(zhì)、翻譯后修飾蛋白、疏水性蛋白和高分子質(zhì)量蛋白的分離分析尤其困難；2）在蛋白質(zhì)組分離方法學(xué)上，2-DE仍是目前最流行和較可靠的技術(shù)，然而重復(fù)性有待提高；3）當(dāng)前的蛋白質(zhì)組學(xué)是相對定量，而非絕對定量，與相對定量相比，絕對定量更有意義，絕對定量分析可以比較不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至有可能比較不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；4）對于沒有完成基因組測序的生物體，研究者無法鑒定出其感興趣的蛋白；5）不能實(shí)時(shí)監(jiān)測蛋白質(zhì)組發(fā)生的變化；6）數(shù)據(jù)的解釋，即從蛋白質(zhì)組分析實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)中提取有用的信息，仍然是一個主要問題，有許多質(zhì)譜圖不能用于鑒定，可能的原因有很多，如譜圖質(zhì)量不高，搜索參數(shù)設(shè)置不正確，肽段帶有修飾或突變，或者質(zhì)譜圖質(zhì)量很好，但是數(shù)據(jù)庫中沒有可以匹配的肽段，或數(shù)據(jù)庫中的序列有誤；7）從蛋白質(zhì)鑒定來說，數(shù)據(jù)庫依賴性強(qiáng)，價(jià)格昂貴，存在一定的假陽性結(jié)果。這些存在的問題，都需要進(jìn)一步的改進(jìn)和完善。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在醋酸菌研究中的應(yīng)用

微生物基因組相對較小，這使其成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的首選模式生物；高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)方法也為微生物學(xué)家提供了新的選擇。利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，人們解決了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、蛋白質(zhì)的相互作用、細(xì)胞代謝機(jī)制、脅迫應(yīng)答機(jī)制等諸多問題。近些年，蛋白質(zhì)組學(xué)研究在食品工業(yè)微生物中被廣泛應(yīng)用，如芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、鏈霉菌等[28-31]。作為食醋生產(chǎn)中起主要作用的醋酸菌，近些年也有研究。

醋酸菌是嚴(yán)格好氧的革蘭氏陰性菌，具有特有的乙醇和乙酸耐受特性。醋酸菌包括13 個屬，其中醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖桿菌屬（Gluconacetobacter）能夠通過乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）將乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸[32]。近年來，科學(xué)家們利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了醋酸菌高耐酸性的分子機(jī)制，以及醋酸菌蛋白質(zhì)組成與調(diào)控的活動規(guī)律，嘗試全面揭示醋酸菌生命活動的本質(zhì)[33-35]。1997年，Lasko等[36]首次利用2-DE技術(shù)，比較了醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）和氧化葡糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）在有無乙酸條件下生長的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)有8 個與醋酸應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)在乙酸脅迫下過量表達(dá)，其中3 個蛋白質(zhì)在2 種菌中都存在。隨后，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，Steiner等[37]研究了在批次培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)中A.aceti對高濃度醋酸適應(yīng)的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)至少有50 個蛋白質(zhì)可被乙酸進(jìn)行特異性誘導(dǎo)；這些蛋白質(zhì)主要是醋酸適應(yīng)蛋白（acetete adaptation proteins，Aaps）、醋酸誘導(dǎo)蛋白和一般的應(yīng)激蛋白。在此基礎(chǔ)上，對被誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的N端氨基酸殘基進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明質(zhì)膜相關(guān)的過程對醋酸適應(yīng)很重要。這些研究表明，基于2-DE的蛋白質(zhì)組策略可有效闡明醋酸菌的耐酸分子機(jī)制，然而上述研究并未對差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。Nakano等[38-39]分別于2004年和2006年鑒定了A.aceti菌株中對醋酸最敏感的蛋白質(zhì)—順烏頭酸酶和假定ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而證明它們與醋酸抗性有關(guān)。2008年，Lery等[40]對固氮醋桿菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）的蛋白表達(dá)譜進(jìn)行研究，鑒定了583 個蛋白，進(jìn)而利用蛋白功能分類和京都基因及基因組全庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）途徑對這些蛋白進(jìn)行分析，從而揭示了醋酸菌的代謝基礎(chǔ)和代謝調(diào)控機(jī)制。同年，Lery等[41]對不同生長時(shí)期和不同培養(yǎng)條件下（無機(jī)氮化合物水平）G.diazotrophicus的差異蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)傳感器蛋白KdpD（sensor protein KdpD）和ATP合成酶δ鏈（ATP synthase delta chain，AtpD）在G.diazotrophicus細(xì)胞指數(shù)生長期的高酸性條件下，參與維持細(xì)胞內(nèi)pH值動態(tài)平衡，表明G.diazotrophicus細(xì)胞在指數(shù)生長期的高耐酸性，是由一組特殊的蛋白質(zhì)介導(dǎo)；另外在生長平臺期，即低氮、低碳、高酸性環(huán)境下，G.diazotrophicus細(xì)胞主要是通過激活一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)移酶來維持細(xì)胞的正常生理活性，進(jìn)一步闡明了醋酸菌耐酸性相關(guān)的分子機(jī)制。

2010年對G.diazotrophicus的研究結(jié)果表明，36 個差異蛋白與碳水化合物和能量代謝、折疊、分類和降解過程、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯過程相關(guān)[42]。最近，Andrés-Barrao 等[34]對Acetobacter pasteuianus在醋酸發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，鑒定了53個蛋白質(zhì)，比較發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的折疊、壓力反應(yīng)、氧化還原過程、代謝過程、蛋白質(zhì)生物合成和翻譯，以及膜修飾蛋白相關(guān)。施結(jié)燕[43]通過對醋酸菌耐高酸性的差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，鑒定了26 個與醋酸菌耐高醋酸有關(guān)的蛋白，進(jìn)一步闡明醋酸菌的耐酸性分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法完成了從鎮(zhèn)江香醋醋醅中分離的A.pasteuianus HSZ3-21的蛋白表達(dá)譜，并且鑒定出258 個蛋白質(zhì)[35]。通過基因聚類（gene ontology，GO）分析和蛋白相鄰類的聚簇（clusters of orthologous groups of proteins，GOG）蛋白功能分類等生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，258 個蛋白可以分為四大組19 類蛋白質(zhì)，其中大部分蛋白質(zhì)與代謝過程、細(xì)胞過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)；一些蛋白質(zhì)與A.pasteuianus的耐酸性、耐熱性以及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。這項(xiàng)研究不僅解釋了A.pasteuianus蛋白質(zhì)的組成和功能，且發(fā)現(xiàn)了一些可能參與某些調(diào)控機(jī)制的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步提高鎮(zhèn)江香醋品質(zhì)提供了參考。

在食醋工業(yè)方面，通過對醋酸菌以往的研究以及結(jié)合近十幾年對醋酸菌的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，揭示了醋酸菌耐酸性相關(guān)的幾種分子機(jī)制。醋酸在細(xì)胞內(nèi)部的循環(huán)可能是：1）通過三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)代謝；2）由假定的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)；3）由質(zhì)子動力依賴外排泵泵出胞外；從而降低細(xì)胞內(nèi)的醋酸濃度。其中，ADH和ALDH像TCA循環(huán)中的酶一樣，會產(chǎn)生能量來維持假定ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能；具有耐低pH值的細(xì)胞內(nèi)胞漿酶可以通過應(yīng)激蛋白如GroES和GroEL防止其變性，而磷脂酰膽堿可能也參與了耐醋酸性質(zhì)的形成過程（圖1）[33]。

圖1　醋酸桿菌和葡糖醋桿菌耐醋酸的分子機(jī)制示意圖[[3333]]Fig.1 Schematic representation of molecular mechanisms for acetic acid resistance of Acetobacter and Gluconacetobacter[33]

乙醇氧化反應(yīng)機(jī)制，包括膜結(jié)合的ADH和ALDH；醋酸同化相關(guān)機(jī)制，包括基因aarA、aarC和烏頭酸酶基因；一個假定的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可能作為乙酸的輸出者。這些發(fā)現(xiàn)為食醋發(fā)酵培育高耐酸性的菌株提供了線索。

通過對醋酸菌耐酸的分子機(jī)制、蛋白質(zhì)組成及調(diào)控機(jī)制的更深入的了解，蛋白質(zhì)組學(xué)將對醋酸菌的代謝機(jī)制及醋酸菌的開發(fā)和應(yīng)用起到積極的促進(jìn)作用，為進(jìn)一步提高醋酸菌的耐高酸性提供理論基礎(chǔ)，從而為選育和改造優(yōu)良菌種提供了理論依據(jù)，并為發(fā)酵食醋產(chǎn)業(yè)中高濃度醋酸的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

4　結(jié) 語

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，包括微生物、動物和植物等，涉及了生物體蛋白的各種研究，如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，相互作用，代謝機(jī)制等，這些研究為生物應(yīng)用研究的快速發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。以目前技術(shù)突破的速度，在接下來的10 a中，微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究將使人們更全面了解微生物隨著細(xì)胞增長和環(huán)境變化的分子和動力學(xué)機(jī)制[44-46]。

建立醋酸菌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫對研究菌株生長發(fā)育機(jī)理，耐酸、耐高溫等代謝及調(diào)控機(jī)制以及菌種的改良有著重要意義。通過對醋酸菌蛋白質(zhì)組的分析，有利于發(fā)現(xiàn)和醋酸菌耐酸、耐熱等特性相關(guān)的基因，從而加快醋酸菌種的改良，進(jìn)一步改善食醋工業(yè)的醋酸產(chǎn)量。因此蛋白質(zhì)組的研究，將為醋酸菌在食醋工業(yè)上提供更廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]SIRAGUSA S,de ANGELIS M,CALASSO M,et al.Fermentation and proteome profiles of Lactobacillus plantarum strains during growth under food-like conditions[J].Journal of Proteomics,2014,96:366-380.DOI:10.1016/j.jprot.2013.11.003.

[2]MUNTEL J,FROMION V,GOELZER A,et al.Comprehensive absolute quantifi cation of the cytosolic proteome of Bacillus subtilis by data independent,parallel fragmentation in liquid chromatography/mass spectrometry(LC/MS(E))[J].Molecular & Cellular Proteomics,2014,13(4):1008-1019.DOI:10.1074/mcp.M113.032631.

[3]HEBERT A S,RICHARDS A L,BAILEY D J,et al.The one hour yeast proteome[J].Molecular & Cellular Proteomics,2014,13(1):339-347.DOI:10.1074/mcp.M113.034769.

[4]WILKINS M R,GASTEIGER E,TONELLA L,et al.Protein identification with N and C-terminal sequence tags in proteome projects[J].Journal of Molecular Biology,1998,278(3):599-608.DOI:10.1006/jmbi.1998.1726.

[5]DOHERTY M K,WHITFIELD P D.Proteomics moves from expression to turnover:update and future perspective[J].Expert Review of Proteomics,2011,8(3):325-334.DOI:10.1586/epr.11.19.

[6]BALDI P,BRUNAK S.Bioinformatics:the machine learning approach[M].2nd ed.Cambridge:MIT Press,2001:16-24.

[7]許克新,王云川.雙向電泳及質(zhì)譜分析與蛋白組研究[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002(22):2017-2022.

[8]皇甫海燕,官春云,郭寶順,等.蛋白質(zhì)組學(xué)及植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].作物研究,2006(5):577-581.

[9]UNLU M,MORGAN M E,MINDEN J S.Difference gel electrophoresis:a single gel method for detecting changes in protein extracts[J].Electrophoresis,1997,18(11):2071-2077.DOI:10.1002/elps.1150181133.

[10]FODOR I K,NELSON D O,ALEGRIA-HARTMAN M,et al.Statistical challenges in the analysis of two-dimensional difference gel electrophoresis experiments using DeCyder[J].Bioinformatics,2005,21(19):3733-3740.DOI:10.1093/bioinformatics/bti612.

[11]WINNIK W M,DEKROON R M,JEONG J S,et al.Analysis of proteins using DIGE and MALDI mass spectrometry[J].Methods in Molecular Biology,2012,854:47-66.DOI:10.1007/978-1-61779-573-25.

[12]van den BERGH G,ARCKENS L.Fluorescent two-dimensional difference gel electrophoresis unveils the potential of gel-based proteomics[J].Current Opinion in Biotechnology,2004,15(1):38-43.DOI:10.1016/j.copbio.2003.12.001.

[13]dos SANTOS CASTRO L,PEDERSOLI W R,ANTONIETO A C,et al.Comparative metabolism of cellulose,sophorose and glucose in Trichoderma reesei using high-throughput genomic and proteomic analyses[J].Biotechnology for Biofuels,2014,7(1):41.DOI:10.1186/1754-6834-7-41.

[14]WU L,HAN Z,WANG S,et al.Comparative proteomic analysis of the plant-virus interaction in resistant and susceptible ecotypes of maize infected with sugarcane mosaic virus[J].Journal of Proteomics,2013,89:124-140.DOI:10.1016/j.jprot.2013.06.005.

[15]ZHANG L,ZHANG X,GAO Y,et al.Identifi cation of differentially expressed proteins in the ovaries of menopausal women[J].Archives of Gynecology and Obstetrics,2014,290(6):1179-1186.DOI:10.1007/s00404-014-3357-7.

[16]GIDDINGS J C.Concepts and comparisons in multidimensional separation[J].Journal of High Resolution Chromatography,1987,10(5):319-323.DOI:10.1002/jhrc.1240100517.

[17]WANG H,HANASH S.Multi-dimensional liquid phase based separations in proteomics[J].Journal of Chromatography B,2003,787(1):11-18.DOI:10.1016/S1570-0232(02)00335-5.

[18]HU L,ZHOU H,LI Y,et al.Profiling of endogenous serum phosphorylated peptides by titanium(IV)immobilized mesoporous silica particles enrichment and MALDI-TOFMS detection[J].Analytical Chemistry,2009,81(1):94-104.DOI:10.1021/ac801974f.

[19]LI X,UBOH C E,SOMA L R,et al.Sensitive hydrophilic interaction liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for rapid detection,quantification and confirmation of cathinone-derived designer drugs for doping control in equine plasma[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry:RCM,2014,28(2):217-229.DOI:10.1002/rcm.6778.

[20]FORTUIN S,TOMAZELLA G G,NAGARAJ N,et al.Phosphoproteomics analysis of a clinical Mycobacterium tuberculosis Beijing isolate:expanding the mycobacterial phosphoproteome catalog[J].Frontiers in Microbiology,2015,6:6.DOI:10.3389/fmicb.2015.00006.

[21]MANN M,HENDRICKSON R C,PANDEY A.Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry[J].Annual Review of Biochemistry,2001,70:437-473.DOI:10.1146/annurev.biochem.70.1.437.

[22]RAMAUTAR R,HEEMSKERK A A,HENSBERGEN P J,et al.CE-MS for proteomics:advances in interface development and application[J].Journal of Proteomics,2012,75(13):3814-3828.DOI:10.1016/j.jprot.2012.04.050.

[23]BEREMAN M S.Tools for monitoring system suitability in LC MS/MS centric proteomic experiments[J].Proteomics,2015,15(5/6):891-902.DOI:10.1002/pmic.201400373.

[24]KIM M S,PINTO S M,GETNET D,et al.A draft map of the human proteome[J].Nature,2014,509:575-581.DOI:10.1038/nature13302.

[25]KIM M S.Proteomics equipped with multiplexing toward ultra high throughput[J].Proteomics,2015,15(2/3):183-184.DOI:10.1002/pmic.201400593.

[26]ZHANG W,SAKASHITA S,TAYLOR P,et al.Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature(OCT)embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS[J].Methods,2015,81:50-55.DOI:10.1016/j.ymeth.2015.02.008.

[27]GOODMAN N.Biological data becomes computer literate:new advances in bioinformatics[J].Current Opinion Biotechnology,2002,13(1):68-71.DOI:10.1016/S0958-1669(02)00287-2.

[28]ABHYANKAR W,BEEK A T,DEKKER H,et al.Gel-free proteomic identification of the Bacillus subtilis insoluble spore coat protein fraction[J].Proteomics,2011,11(23):4541-4550.DOI:10.1002/pmic.201100003.

[29]GUILLOT A,GITTON C,ANGLADE P,et al.Proteomic analysis of Lactococcus lactis,a lactic acid bacterium[J].Proteomics,2003,3(3):337-354.DOI:10.1002/pmic.200390047.

[30]WASHBURN M P,WOLTERS D,YATES J R.Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology[J].Nature Biotechnology,2001,19(3):242-247.DOI:10.1038/85686.

[31]RAO A A,PATKARI M,REDDY P J,et al.Proteomic analysis of Streptomyces coelicolor in response to Ciprofloxacin challenge[J].Journal of Proteomics,2014,97:222-234.DOI:10.1016/j.jprot.2013.08.013.

[32]MAMLOUK D,GULLO M.Acetic acid bacteria:physiology and carbon sources oxidation[J].Indian Journal of Microbiology,2013,53(4):377-384.DOI:10.1007/s12088-013-0414-z.

[33]NAKANO S,FUKAYA M.Analysis of proteins responsive to acetic acid in Acetobacter:molecular mechanisms conferring acetic acid resistance in acetic acid bacteria[J].International Journal of Food Microbiology,2008,125(1):54-59.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.05.015.

[34]ANDRéS-BARRAO C,SAAD M M,CHAPPUIS M L,et al.Proteome analysis of Acetobacter pasteurianus during acetic acid fermentation[J].Journal of Proteomics,2012,75(6):1701-1717.DOI:10.1016/j.jprot.2011.11.027.

[35]ZHANG Z,MA H,YANG Y,et al.Protein profile of Acetobacter pasteurianus HSZ3-21[J].Current Microbiology,2015,70(5):724-729.DOI:10.1007/s00284-015-0777-y.

[36]LASKO D R,SCHWERDEL C,BAILEY J E,et al.Acetatespecific stress response in acetate-resistant bacteria:an analysis of protein patterns[J].Biotechnology Progress,1997,13(5):519-523.DOI:10.1021/bp970075f.

[37]STEINER P,SAUER U.Proteins induced during adaptation of Acetobacter aceti to high acetate concentrations[J].Applied and Environmental Microbiology,2001,67(12):5474-5481.DOI:10.1128/AEM.67.12.5474-5481.2001.

[38]NAKANO S,FUKAYA M,HORINOUCHI S.Enhanced expression of aconitase raises acetic acid resistance in Acetobacter aceti[J].FEMS Microbiology Letters,2004,235(2):315-322.DOI:10.1016/j.femsle.2004.05.007.

[39]NAKANO S,FUKAYA M,HORINOUCHI S.Putative ABC transporter responsible for acetic acid resistance in Acetobacter aceti[J].Applied and Environmental Microbiology,2006,72(1):497-505.DOI:10.1128/AEM.72.1.497-505.2006.

[40]LERY L M,COELHO A,von KRUGER W M,et al.Protein expression profile of Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5,a sugarcane endophytic plant growth-promoting bacterium[J].Proteomics,2008,8(8):1631-1644.DOI:10.1002/pmic.200700912.

[41]LERY L M,von KRUGER W M,VIANA F C,et al.A comparative proteomic analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 at exponential and stationary phases of cultures in the presence of high and low levels of inorganic nitrogen compound[J].Biochimica et Biophysica Acta,2008,1784(11):1578-1589.DOI:10.1016/j.bbapap.2008.06.020.

[42]DOS S M,MUNIZ D P V,de MATOS N E,et al.Proteome of Gluconacetobacter diazotrophicus co-cultivated with sugarcane plantlets[J].Journal of Proteomics,2010,73(5):917-931.DOI:10.1016/j.jprot.2009.12.005.

[43]施結(jié)燕.高耐酸性醋酸菌差異蛋白組學(xué)的研究[D].杭州:浙江工商大學(xué),2013:41-51.

[44]BECK M,CLAASSEN M,AEBERSOLD R.Comprehensive proteomics[J].Current Opinion Biotechnology,2011,22(1):3-8.DOI:10.1016/j.copbio.2010.09.002.

[45]TOMANEK L.Environmental proteomics:changes in the proteome of marine organisms in response to environmental stress,pollutants,infection,symbiosis,and development[J].Annual Review of Marine Science,2011,3:373-399.DOI:10.1146/annurevmarine-120709-142729.

[46]ARMENGAUD J.Microbiology and proteomics,getting the best of both worlds![J].Environmental Microbiology,2013,15(1):12-23.DOI:10.1111/j.1462-2920.2012.02811.x.

Advances in Proteomics and Its Application in Acetic Acid Bacteria Research

ZHANG Zhiyan1,2,MA Haile1,*,YANG Yanhua2
(1.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China; 2.Institute of Life Sciences,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Abstract:Proteomic techniques,the most important research tools in the post-genomic era,have been widely applied to research useful microbes such as acetic acid bacteria(AAB)for the food industry.The present paper outlines the concept of proteomics and reviews proteomic techniques and their application in AAB research.Moreover,future applications of AAB proteomics in the vinegar industry are prospected as well.

Key words:proteomics; acetic acid bacteria; two dimensional electrophoresis(2-DE); mass spectrometry(MS)

中圖分類號：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0259-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605045

*通信作者：馬海樂（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苁称?。E-mail：mhl@ujs.edu.cn

作者簡介：張志燕（1977—），女，助理研究員，博士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵和食品生物技術(shù)。E-mail：zyz@ujs.edu.cn

基金項(xiàng)目：江蘇大學(xué)高級人才科研啟動基金項(xiàng)目（05JDG030）

收稿日期：2015-04-15