韓玉生等

摘要：目的 探討姜黃素（curcumin）對老年性癡呆（Alzhelmer'sdisease，AD）大鼠海馬區(qū)β-淀粉樣前體蛋白（amyloid protein precursor，APP）和β-分泌酶（amyloidβsecretase1，BACE1）基因表達的影響。方法 采用Aβ1-40右側(cè)海馬區(qū)注射，制備AD大鼠模型，腹腔注射姜黃素給予治療，采用RT-PCR法檢測海馬組織中β-APP和BACE1mRNA表達。結(jié)果 與正常組相比，模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元中β-APPmRNA和BACE1mRNA表達明顯升高；與模型組相比較，姜黃素各劑量組β-APPmRNA和BACE1mRNA表達有不同程度降低，差異均有顯著性。結(jié)論 姜黃素可通過對BACE1mRNA調(diào)控作用，阻斷β-APP裂解進程，抑制Aβ在腦內(nèi)生成與沉積，從而減少Aβ對神經(jīng)元毒性作用。

關(guān)鍵詞：姜黃素；老年性癡呆；β-APPmRNA；BACE1mRNA

研究表明，Aβ沉積是AD病理機制的中心環(huán)節(jié)和治療靶點， AD治療的關(guān)鍵在于如何抑制Aβ的生成和代謝。姜黃素能夠有效地抑制Aβ的生成和聚集，從而改善AD學習記憶能力A減退和認知功能障礙 [1-2] ，但其具體機制仍然不明確，因此我們進行如下研究。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組 雄性SD大鼠，體重（250±20）g，清潔級，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK黑2008004。給予充足水和食物常規(guī)飼養(yǎng)1w后進行實驗。實驗前經(jīng)Morris水迷宮篩選，將大鼠隨機分成正常組、假手術(shù)組、模型組、姜黃素組低劑量組和姜黃素高劑量組，每組10只。

1.2 主要試劑與儀器 純度99%的姜黃素和Aβ1-40由Sigma公司生產(chǎn)；RT-PCR引物、Trizol RNA抽提試劑盒（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑和DNA marker（AKARA公司）；瓊脂糖和溴化乙啶（美國Amresco公司）。

淮北正華生產(chǎn)的大鼠腦立體定位儀和Morris水迷宮；上海安亭TGL-16G臺式離心機；德國Eppendorf公司5331型PCR擴增儀；美國UVP公司GDS-8000型凝膠成像分析系統(tǒng)；日本島津紫外分光光度計。

1.3 模型制備 Aβ1-40用無菌生理鹽水稀釋后在37℃恒溫箱中孵育7d，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩４笫蠼?jīng)10%的水合氯醛麻醉，固定在大鼠腦立體定位儀上，剪去頭部毛發(fā)，常規(guī)消毒。參考《大鼠腦立體定位圖譜》[3]沿大腦矢狀線切開皮膚暴露出顱骨，注射點選擇：前囟后3mm，中線向右旁開2mm，垂直進針3.5mm，緩慢注射Aβ1-40溶液2ul（10ug），5min內(nèi)注射完，留針5min。顱骨孔用牙科泥封堵后，常規(guī)縫合頭部的皮膚和局部消毒。假手術(shù)組除注入等量無菌雙蒸水外其余處置同模型組。術(shù)后大鼠分別單籠飼養(yǎng)直至完全清醒。

1.4給藥方法 在術(shù)后24h動物清醒后開始給藥。姜黃素用二甲基亞砜（DMSO）溶解，低劑量組和高劑量組分別按150 mg/kg 、300 mg/kg濃度腹腔注射，正常組、假手術(shù)組、模型組大鼠分別腹腔注射等體積的二甲基亞砜，連續(xù)給藥14d 。

1.5指標檢測 各組大鼠在給藥14d后麻醉，心臟灌注生理鹽水后取出大腦，在冰上分離海馬組織用于RT-PCR法檢測大鼠海馬區(qū)腦組織β-APPmRNA和BACE1mRNA表達。具體操作用嚴格按試劑盒說明書進行。

1.6 RT-PCR引物設(shè)計 β-APPmRNA引物序列：上游5-CCCATCAGGGACCAAAACC3'，下游5'GAAGGGCATCGCTTACAAACT3'，長度218bp；BACE1mRNA引物序列：上游5'TTCGTTTGCCCAAGAAA GTAT3'，下游5'GTAGGTATTGCTGAGGAAGGA3'，長度219 bp；β-actin引物序列：上游5-CTCGCTGTCCACCTTCCA-3下游5'GCTGTCACCTTCACCGTTC 3'，長度256 bp。由大連寶生物設(shè)計合成。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）來表示，用SPSS18.0進行統(tǒng)計，采用單因素方差分析，各組間比較t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BACE1mRN和β-APP mRNA在各組大鼠海馬組織中表達 正常組和假手術(shù)組BACE1和β-APP mRNA表達呈現(xiàn)出較暗的條帶，模型組大鼠海馬區(qū)BACE1和β-APP mRNA表達明顯增強，表現(xiàn)為高亮強度的條帶。姜黃素低、高劑量組在不同程度上降低BACE1和β-APP mRNA的表達。結(jié)果見表1與圖。

圖1

3 討論

AD最基本的病理改變是老年斑（senile plaque，SP），"β淀粉樣蛋白級聯(lián)假說"認為，由β-APP經(jīng)BACE1等裂解產(chǎn)生的Aβ異常增加是形成SP的主要原因[4]。動物研究表明：敲除BACE1基因后，Aβ產(chǎn)生顯著減少，在抑制BACE1的表達時，AD模型動物的認知功能障礙明顯得到改善[5-6]。

正常情況下，大量APP代謝主要通過α途徑，不產(chǎn)生Aβ；少量APP經(jīng)β途徑，由β-分泌酶（BACE1）裂解APP，生成可溶性片段sAPPβ和含膜成分的C99，再經(jīng)γ-分泌酶裂解C99產(chǎn)生Aβ[7-8]。在病理狀態(tài)下，APP代謝主要經(jīng)過β途徑，產(chǎn)生大量的Aβ，導致AD發(fā)生。因此，BACE1是Aβ的生成是限速酶，在AD發(fā)病機制中處于核心地位，通過抑制BACE1的表達來調(diào)節(jié)Aβ的代謝，是治療AD的一種有效策略[9]。

在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素能降低AD大鼠血清及海馬組織中Aβ水平，在抑制海馬中β-APP蛋白和基因表達同時，也使BACE1mRNA水平明顯降低。因此我們推測：姜黃素可通過對BACE1mRNA調(diào)控作用，阻斷β-APP裂解進程，抑制Aβ在腦內(nèi)生成與沉積，從而減少Aβ對神經(jīng)元毒性作用。

參考文獻：

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[2]尹紅蕾，秦新月，王運良，等.姜黃素對海馬內(nèi)注射Aβ1-40后大鼠認知功能障礙的影響[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志，2009，12（9）：6-8.

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[9]Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease：progress andproblems on the road to therapeutics[J].Science，2002，297：353-356.編輯/王敏