趙孝梅， 何　燕， 張旺德， 張　婷， 王嬋娟， 吳昌學(xué)， 官志忠

(貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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貴州省布依族和苗族HLA-C基因rs3130542位點(diǎn)多態(tài)性研究*

趙孝梅， 何燕**， 張旺德， 張婷， 王嬋娟， 吳昌學(xué)， 官志忠

(貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 研究HLA -C 基因rs3130542位點(diǎn)在貴州省布依族和苗族人群中的分布特征，探討該位點(diǎn)在不同群體間的分布差異。方法： 應(yīng)用TaqMan-MGB探針基因分型方法，檢測(cè)貴州布依族(289例)和苗族(174例)群體HLA -C 基因rs3130542 SNP多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率及基因型頻率，比較同一性別不同民族及同一民族不同性別人群間HLA -C 基因rs3130542 SNP多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率及基因型頻率，并與人類(lèi)基因組計(jì)劃網(wǎng)站公布的中國(guó)北京人群、日本人群、歐洲人群及非洲人群的分布特點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果： 布依族和苗族群體比較HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同一民族群體不同性別之間比較HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)多態(tài)性分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與人類(lèi)基因組計(jì)劃網(wǎng)站公布的其他人群相比，貴州苗族布依族人群HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)的基因型頻率與中國(guó)北京人群間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，等位基因和基因型頻率與日本人群間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與歐洲人群間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，等位基因頻率與非洲人群間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論： HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)在不同地域、不同民族或種族之間分布存在一定的差異；但在貴州省苗族和布依族同一民族男女性別中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

[關(guān)鍵詞]HLA-C抗原； 基因多態(tài)性； 等位基因； 基因型； 少數(shù)民族

HLA-C是人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)的一個(gè)基因座，屬于經(jīng)典的HLA-Ι類(lèi)分子。HLA-C所含的等位基因相對(duì)較少但存在著高度的多態(tài)性[1]。近年來(lái)有關(guān)HLA-C基因多態(tài)性與疾病進(jìn)展的研究不斷地增加和深入，發(fā)現(xiàn)HLA-C基因多態(tài)性與許多疾病如HBV感染[2]、HIV感染[3]、神經(jīng)纖維瘤病Ι型[4]、早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[5]、梅毒[6]、人類(lèi)T淋巴細(xì)胞白血病病毒I型(HTLV-1)[7]等均存在一定的相關(guān)性。由于特定的生活習(xí)俗和特殊的地理分布使得某些疾病在少數(shù)民族人群中發(fā)病率較高，因此本研究選取貴州省人口較多的2個(gè)少數(shù)民族(布依族和苗族)為研究對(duì)象，分析其群體中HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)的分布特征，為進(jìn)一步研究HLA-C 基因與某些疾病的相關(guān)性及關(guān)聯(lián)機(jī)制提供一定的參考，同時(shí)也為群體遺傳學(xué)的研究提供一定的基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

根據(jù)知情同意原則，隨機(jī)采集貴州省世居布依族和苗族無(wú)關(guān)個(gè)體外周血2 mL，所選的研究對(duì)象三代內(nèi)均無(wú)族外通婚，彼此間無(wú)直接的血緣關(guān)系，無(wú)遺傳病史。兩個(gè)民族共463例。其中，布依族289例, 男134例，(50.17±9.19)歲，女155例，(48.12±3.54)歲；苗族174例，男70例，(49.99±19.80)歲，女104例，(49.14±19.80)歲。兩個(gè)民族研究對(duì)象的年齡和性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1DNA提取采用德國(guó)QIAGEN公司的FlexiGenen DNA Kit 全血基因組DNA提取試劑盒提取外周血DNA，并進(jìn)行DNA濃度和純度檢測(cè)(DU 640蛋白質(zhì)核酸定量分析儀，美國(guó)Beckman公司)，DNA終濃度標(biāo)化至30 g/L，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2基因分型采用美國(guó)ABI公司的StepOne plus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和TaqMan SNP Genotyping Assays對(duì)HLA-C基因rs3130542位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)為10 μL體系：DNA溶液(30 g/L)1.5 μL，×Taqman Universal Master Mix 5.0 μL，20×Assay Working Stock 0.25 μL加ddH2O補(bǔ)足10 μL。PCR反應(yīng)條件為：60 ℃ 30 s，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min， 共55個(gè)循環(huán)，60 ℃ 30 s。用Step One Software v2.1軟件根據(jù)熒光發(fā)光的特點(diǎn)分析基因分型的結(jié)果。

1.2.3測(cè)序驗(yàn)證根據(jù)基因分型結(jié)果，每種基因型隨機(jī)抽取5個(gè)樣本送Life公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序引物如下：上游5′-GACTTCCCGCAACAACAG-3′，下游5′-CAT CTTTCCACCCATTCC-3′。

1.3觀(guān)察指標(biāo)

對(duì)采集的血液標(biāo)本進(jìn)行基因型和等位基因頻率Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，觀(guān)察布依族和苗族人群rs3130542位點(diǎn)基因型和等位基因頻率，比較兩個(gè)群體間不同性別個(gè)體、群體內(nèi)部不同性別個(gè)體的rs3130542位點(diǎn)基因型和等位基因頻率，并將貴州地區(qū)苗族布依族人群中HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)的多態(tài)性分布頻率與人類(lèi)基因組計(jì)劃網(wǎng)站(http://www.hapmap.org)公布的不同地區(qū)人群的掃描結(jié)果進(jìn)行比較。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

卡方檢驗(yàn)分析rs3130542位點(diǎn)基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用SPSS19.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，基因型和等位基因型頻率用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，組間分布差異用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)

本研究群體基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)，提示本研究所選取的樣本具有較好的群體代表性。

2.2HLA-C基因rs3130542 SNP位點(diǎn)基因分型

注：A為HLA-C A/G 位點(diǎn)PCR擴(kuò)增圖；B 為SNP分型圖，圖中紅點(diǎn)代表野生型HLA-C AA純合子，藍(lán)點(diǎn)代表純合突變型HLA-C GG，綠點(diǎn)代表雜合型HLA-C AG，黑色方塊代表空白對(duì)照(NTC)圖1　人基因組rs3130542(HLA-C)SNP位點(diǎn)的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果Fig.1　The genotyping results of rs3130542 (HLA-C) SNP loci by using TaqMan probe real-time quantitative PCR

2.2.1HLA-C基因分型人基因組rs3130542(HLA-C)SNP位點(diǎn)的TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖1A。根據(jù)人基因組rs3130542(HLA-C)TaqMan探針?lè)中驮噭┖?TaqMan? SNP Genotyping Assays)信息，并采用StepOne Software v2.1軟件分析PCR 擴(kuò)增后收集的熒光，等位基因分布圖中X軸代表VIC探針(HLA-C AA)，Y軸代表FAM 探針(HLA-C GG)，樣品集中分布在4個(gè)區(qū)域：3個(gè)空白對(duì)照組在接近原點(diǎn)的對(duì)角線(xiàn)上，靠近X軸的紅點(diǎn)代表該樣本為HLA-C AA野生型；靠近Y軸的藍(lán)色點(diǎn)則代表該樣本為HLA-C GG純合突變型；處于對(duì)角線(xiàn)上的綠色點(diǎn)則為HLA-C AG雜合型(圖1B)。2.2.2測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果從HLA-C A/G(rs3130542)基因分型結(jié)果中隨機(jī)選取5%的樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果顯示與TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)基因分型的結(jié)果完全符合。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3同一性別不同民族群體HLA-C A/G(rs3130542)基因分型和等位基因頻率分布

布依族與苗族群體比較HLA-C A/G(rs3130542)基因型(χ2=7.987，P=0.018)及等位基因頻率(χ2=8.742，P=0.003)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。男性群體中，布依族、苗族人群比較HLA-C A/G(rs3130542)基因型及等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；女性群體中，布依族和苗族人群比較HLA-C A/G(rs3130542)等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.876，P=0.027)，基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.4同一民族不同性別人群中HLA-C A/G(rs3130542)基因型及等位基因頻率分布

貴州省布依族和苗族同一群體不同性別之間比較，HLA-C A/G(rs3130542)基因型分布和等位基因頻率均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

注： A、B、C分別代表測(cè)序結(jié)果為AA純合子、GG純合子和AG雜合子(箭頭所指處)圖2　HLA-C基因rs3130542(A/G)位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果Fig.2　The sequencing results of HLA-C gene rs3130542 (A / G) locus

2.5貴州地區(qū)苗族布依族人群與其它地區(qū)人群HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)多態(tài)性的比較

將貴州地區(qū)苗族布依族人群中HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)的多態(tài)性分布頻率與人類(lèi)基因組計(jì)劃網(wǎng)站(http://www.hapmap.org)公布的其它地區(qū)人群的掃描結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，貴州地區(qū)苗族布依族人群HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)與與中國(guó)北京人群比較基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與日本人群(JPT)比較基因型和等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與歐洲人群(CEU)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與非洲人群(YRI)比較等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表1　貴州省布依族和苗族群體HLA-C基因rs3130542位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布(n,%)

表2　同一性別布依族和苗族群體HLA-C基因rs3130542位點(diǎn)

表3　貴州省布依族和苗族同一群體不同性別個(gè)體HLA-C基因rs3130542位點(diǎn)

表4　不同地區(qū)人群HLA-C A/G(rs3130542)基因型及等位基因頻率比較(n,%)

3討論

HLA-C可作為殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglo-bulin-like receptor, KIR)的配體，并與之相結(jié)合影響NK細(xì)胞的活性[8-9]，進(jìn)而在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。而國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃(Hap map project)指出人類(lèi)基因組中約有300多萬(wàn)個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)[10]。SNP具有多態(tài)信息含量大、密度高、遺傳穩(wěn)定和易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因而非常適宜用于常見(jiàn)疾病的易感基因研究。

本研究的受檢人群中，布依族和苗族比較HLA-C A/G(rs3130542)等位基因頻率和基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此可推測(cè)HLA-C基因rs3130542 SNP位點(diǎn)多態(tài)性分布存在民族差異性。雖然布依族和苗族同為漢藏語(yǔ)系，但二者分屬不同的語(yǔ)族群體(分別為壯侗語(yǔ)族、苗瑤語(yǔ)族)，隨著歷史的不斷演變與人類(lèi)的進(jìn)化已使它們各自的遺傳背景發(fā)生了一定的改變，進(jìn)一步導(dǎo)致遺傳多樣性和特異性的存在。同一性別不同民族群體之間比較結(jié)果顯示，女性群體中布依族和苗族人群比較HLA-C基因rs3130542 SNP位點(diǎn)等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而同一民族群體不同性別之間比較HLA-C基因rs3130542 SNP位點(diǎn)多態(tài)性分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示HLA-C基因rs3130542 SNP位點(diǎn)多態(tài)性分布的性別差異性不明顯。

貴州地區(qū)苗族布依族人群與人類(lèi)基因組計(jì)劃網(wǎng)站公布的不同地區(qū)及種族的HLA-C基因rs3130542 SNP位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行比較可知：貴州苗族布依族人群和北京人群雖然種族相同、地理位置相對(duì)較近，但二者HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)等位基因頻率的分布還是存在一定的差異性，提示可能為民族差異所致；從地域角度講，貴州苗族布依族人群和日本人群在遺傳學(xué)分類(lèi)上同屬東亞人群，但由于中國(guó)和日本之間存在地理隔離，影響了基因的交匯，從而造成了地區(qū)間基因的差異[11]；貴州苗族布依族人群與非洲人群比較等位基因頻率差異明顯，說(shuō)明HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)存在種族和地域的差異性；而貴州苗族布依族人群與歐洲人群雖存在種族和地域的差異，但二者HLA-C 基因rs3130542位點(diǎn)的分布卻很相似，其原因還需綜合所有可能相關(guān)的因素進(jìn)一步分析探究。

中國(guó)是一個(gè)多民族的國(guó)家，而貴州又是一個(gè)擁有17種世居少數(shù)民族的多民族聚居的省份，其中苗族、布依族為全省人口數(shù)最多的兩個(gè)民族，了解貴州苗族、布依族的HLA-C基因多態(tài)性的分布情況可為接下來(lái)進(jìn)一步研究HLA-C基因多態(tài)性與一些疾病的發(fā)生與進(jìn)展的關(guān)聯(lián)提供一定的理論依據(jù)，從而有助于深入了解某些疾病在不同種族及地區(qū)之間的遺傳背景的差異，以達(dá)到了解、預(yù)防和治療疾病的目的。

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(2015-10-15收稿，2015-12-05修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

A Study ofHLA-C gene rs3130542 SNP Polymorphism in Buyi and Miao Ethnics Groups in Guizhou

ZHAO Xiaomei, HE Yan, ZHANG Wangde, ZHANG Ting, WANG Chanjuan, WU Changxue, GUAN Zhizhong

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate distribution characteristics of rs3130542 site of HLA-C gene Buyi and Miao ethnics and explore its distribution differences in different minorities. Method: TaqMan-MGB based on real-time PCR was used to determine the gene frequencies and genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism in Buyi ethnics(289 cases) and Miao ethnics(174 cases) of Guizhou. The gene frequencies and genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism were compared between the same sex people in different nationalities, between the same nationalities in different sexes and between Guizhou population and other populations of different regions and ethnic groups whose gene information was published by Human Genome Project. Results: There were significant differences of allele gene frequencies and genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism between Buyi nationality and Miao nationality (P<0.05). No statistically significant difference was found between male and female in the same ethnic group about HLA-C gene rs3130542 polymorphism distribution (P>0.05). There were statistically significant differences of genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism between the Buyi, Miao ethnic groups in Guizhou and the Beijing Chinese people (P<0.05). There were significant differences of allele frequencies and genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism between Buyi, Miao nationality and Japanese population (P<0.05) and there were significant differences of allele gene frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP polymorphism between Buyi, Miao nationality and African population (P<0.05). However, no significant difference was found in allele frequencies and genotype frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP between the Buyi , Miao ethnic groups and European population. Conclusion: The allele and genotypes frequencies of HLA-C gene rs3130542 SNP locus show significant differences among different ethnic groups, regional groups and racial groups. No significant difference is found between the male and female of the Buyi and Miao ethnic groups in Guizhou about HLA-C gene rs3130542 polymorphism distribution.

[Key words]HLA-C antigens; gene polymorphism; alleles; genotype; minority groups

[中圖分類(lèi)號(hào)]R342

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)01-0012-05

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAI05B03)； 貴州省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”[黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心(2014)06號(hào)]

**通信作者 E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.2118.062.html