摘 要 [目的]以景天科多肉植物為外植體，探索其植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系，篩選誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方。[方法]首先采用Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)找出對(duì)多肉植物愈傷組織誘導(dǎo)影響顯著的因子；然后通過(guò)Box-Behnken（BB）實(shí)驗(yàn)摸索出顯著影響因子的最優(yōu)濃度，確定誘導(dǎo)愈傷組織最優(yōu)的培養(yǎng)基配方。[結(jié)果]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NAA、6-BA、AC濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響極為顯著；在最優(yōu)條件下，即誘導(dǎo)階段的最佳培養(yǎng)基配方為MS+2.40 mg/L 6-BA+0.70 mg/L NAA+2.00 g/L AC 時(shí)，BB實(shí)驗(yàn)確定最大誘導(dǎo)率的理論值為94.7%；回歸模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，最優(yōu)條件下，‘虹之玉’ ‘姬朧月’ ‘新玉綴’誘導(dǎo)率分別為83.3%、100%、91.7%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論值接近，證明了該培養(yǎng)基配方用于景天科多肉植物愈傷組織誘導(dǎo)具有可行性。[結(jié)論]利用Design-Expert.8.0.6軟件篩選植物組織培養(yǎng)中的積極影響因子，有效避免了在后期的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中由于因子數(shù)太多或部分因子不顯著而浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)資源。

關(guān)鍵詞 景天科；多肉植物；組織培養(yǎng)；愈傷組織；誘導(dǎo)體系；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.25.018

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20161010.0954.021.html 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-10-10 9：54：00

多肉植物（Succulent）也稱(chēng)多漿植物、多汁植物、肉質(zhì)植物[1]，多肉植物在花卉市場(chǎng)中占有一席之地。多肉植物因具各異的形態(tài)、斑斕的色彩，深受各地花友的熱愛(ài)，憑借其獨(dú)特的外觀，帶來(lái)銷(xiāo)量的增加和消費(fèi)者的劇增，價(jià)格居高不下[2]。時(shí)下，賣(mài)得最火的多肉植物當(dāng)屬景天科多肉植物，因其具有艷麗多彩的外觀、適應(yīng)性強(qiáng)、耐長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)忍匦裕殉蔀榫W(wǎng)購(gòu)中的“新寵兒”。高利潤(rùn)使得景天科多肉植物形成了巨大的市場(chǎng)空洞。除其具有較高的觀賞價(jià)值外，多肉植物正朝著更為廣闊的經(jīng)濟(jì)空間發(fā)展。大多珍稀多肉植物品種的自然繁殖率低，采用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖多肉植物，有利于保存多肉植物優(yōu)良的種質(zhì)資源、繁殖珍稀品種、快速繁殖藥用植物和園林綠化需要的優(yōu)良品種。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)采用的景天科植物均系采購(gòu)自浙江省嘉興市花卉市場(chǎng)人工種植的盆栽苗。

MS培養(yǎng)基、蔗糖、瓊脂、NAA、6-BA、2，4-D、KT、AC、無(wú)水乙醇、酒精棉球、無(wú)菌水、蒸餾水等。

主要儀器及設(shè)備：電子天平、滅菌鍋、超凈臺(tái)、光照培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、接種工具、移液槍、酒精燈、封口膜、培養(yǎng)基煮鍋。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的選取與預(yù)處理

取生長(zhǎng)健壯的葉肉、莖段，用自來(lái)水沖洗多次，再用蒸餾水沖洗。將莖段分為上中下三段，分別放于75%酒精中浸泡30 s，再轉(zhuǎn)移到2%NaClO溶液中浸泡15 min[3]。消毒后的外植體在無(wú)菌平板里用無(wú)菌水沖洗5～6次，洗凈浸泡殘留溶液。將洗凈的外植體莖段剪成0.5～1.0 cm長(zhǎng)，葉肉剪成0.5 cm×0.5 cm大小備用。

1.2.2 培養(yǎng)基配置

根據(jù)Design-Expert.8.0.6 軟件設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行培養(yǎng)基配置。以MS-含蔗糖和瓊脂的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上根據(jù)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基配方，分別添加不同含量的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和活性炭。將配置好的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)瓶，每瓶40 mL，做好標(biāo)記，于121℃下高溫滅菌20 min，冷卻待用。

1.2.3 接種

接種在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。將預(yù)處理好的外植體接入培養(yǎng)基，每瓶4～5個(gè)外植體，接入深度約0.5 cm，以保證莖節(jié)不脫落且能很好吸收營(yíng)養(yǎng)。

1.2.4 培養(yǎng)條件控制

培養(yǎng)室溫度（25±1） ℃，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1500～3000 lx，培養(yǎng)基pH為5.6～6.0，空氣相對(duì)濕度70%～80%[4]。

1.2.5 Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

多肉植物愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中NAA、6-BA、2，4-D、KT和AC[5]被確定為最重要的變量。設(shè)計(jì)如表1的高低兩水平（1， -1），以愈傷組織誘導(dǎo)率為響應(yīng)結(jié)果。

1.2.6 Box-Behnken（BB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)所選因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以愈傷組織誘導(dǎo)率為響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面分析并建立二次響應(yīng)面回歸模型，得出最佳工藝條件，獲得最佳愈傷組織誘導(dǎo)率培養(yǎng)基配方，并通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證分析。

2結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert.8.0.6軟件進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)，根據(jù)結(jié)果的方差分析確定影響較為顯著的因素，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Design-Expert.8.0.6軟件對(duì)PB實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，其相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表 3。

采用Design expert 8.0.6軟件進(jìn)行顯著評(píng)估和方差分析，獲得影響愈傷組織形成的因素于表3。表3表明模型方面具有顯著性，且6-BA、NAA、AC有顯著水平（P<0.05），2，4-D和KT不顯著（P>0.05）。從圖1可以直觀看出顯著因素為6-BA、NAA、AC，與實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果一致，因此，篩選出影響姬朧月組織培養(yǎng)愈傷組織形成的顯著因子為：6-BA、NAA、AC。

2.2響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)

基于Plackett-Burman設(shè)計(jì)，以愈傷組織誘導(dǎo)率為響應(yīng)因子，設(shè)計(jì)NAA、6-BA和AC三個(gè)因素的三個(gè)水平（見(jiàn)表4）。

利用Design-expert 8.0.6 軟件Box-Behnken設(shè)計(jì)的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以6-BA、NAA、AC為自變量，以愈傷組織誘導(dǎo)率為響應(yīng)指標(biāo)，采用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。

根據(jù)表5實(shí)驗(yàn)組結(jié)果，利用Design-Expert.8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[6-7]，其回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析見(jiàn)表6。

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)（表6）表明：NAA、6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的線性效應(yīng)極顯著（P<0.01），AC對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的線性效應(yīng)不顯著；因素A2、B2、C2對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的曲面效應(yīng)極顯著，因素AB、AC、BC對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的交互影響不顯著。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多次擬合回歸，以誘導(dǎo)率（Y）為因變量，NAA（A）、6-BA（B）、AC（C）為自變量建立回歸方程模型為：

Y=-70.21+56.90B+214.20A+22.30C-12.50BA-6.20BC+4.20AC-10.00B2-143.30A2-5.80C2。

模型的回歸F值為15.93，P=0.0007（P<0.05），表明該模型回歸極顯著，模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好。在擬合模型中，殘差的正態(tài)概率分布為一條直線，說(shuō)明潛在的誤差分布是正態(tài)的，進(jìn)一步說(shuō)明在進(jìn)行回歸擬合時(shí)進(jìn)行的假設(shè)是合理的，擬合得到的回歸模型也是合適的。

此外，失擬項(xiàng)P>0.05，表明失擬項(xiàng)差異不顯著，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值擬合較好，該模型對(duì)于響應(yīng)實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有很好的擬合度，可以用該模型對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行很好的分析、預(yù)測(cè)和確定最佳工藝。

2.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)條件優(yōu)化

通過(guò)Design-expert 8.0.6軟件分析優(yōu)化，景天科多肉植物愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為：2.42 mg/L 6-BA，0.67 mg/L NAA，2.15 g/L AC，此條件下愈傷組織誘導(dǎo)率理論值為94.70%。

2.2.3 回歸模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢測(cè)所得結(jié)果的可靠性，對(duì)優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，選用‘虹之玉’‘姬朧月’‘新玉綴’3個(gè)景天科植物品種為驗(yàn)證對(duì)象。取MS+2.40 mg/L 6-BA+0.70 mg/L NAA+2.00 g/L AC為啟動(dòng)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)以上3個(gè)品種愈傷組織的形成。接種7 d后能觀察到外植體膨大，14 d后有愈傷組織形成，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

由驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，該驗(yàn)證結(jié)果‘虹之玉’‘姬朧月’‘新玉綴’愈傷組織誘導(dǎo)率分別為83.33%、100%、91.70%，數(shù)值與優(yōu)化理論值接近，證明了該培養(yǎng)基配方用于景天科多肉植物愈傷組織誘導(dǎo)具有可行性。

3結(jié)論

該項(xiàng)研究對(duì)景天科多肉植物愈傷組織誘導(dǎo)條件使用Design-Expert.8.0.6 軟件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中篩選出了3個(gè)顯著因子：6-BA、NAA、AC。并用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，得到最優(yōu)條件為：2.42 mg/L 6-BA、0.67 mg/L NAA、2.15 g/L AC，此條件下‘姬朧月’品種愈傷組織誘導(dǎo)率理論值為94.70%。通過(guò)回歸模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，‘姬朧月’的實(shí)測(cè)誘導(dǎo)率為100%，‘虹之玉’為83.33%，‘新玉綴’為91.70%，與理論值較為接近，證明了該培養(yǎng)基配方用于景天科多肉植物愈傷組織誘導(dǎo)具有可行性。通過(guò)對(duì)景天科多肉植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，獲取最佳培養(yǎng)基配方，可有效縮短愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間。利用響應(yīng)面法對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，可節(jié)約生產(chǎn)工藝成本，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工藝?yán)麧?rùn)最大化。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）