蘇文俏，彭艷梅，李躍輝，周潤維，朱立華

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院，長沙410013;2.湖南國華制藥有限公司，長沙410013)

天麻首烏片的HPLC指紋圖譜研究*

蘇文俏1，彭艷梅1，李躍輝1，周潤維1，朱立華2△

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院，長沙410013;2.湖南國華制藥有限公司，長沙410013)

目的:建立天麻首烏片的高效液相色譜指紋圖譜。方法:采用Kromasil C18(250×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-0.3%磷酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫(0～18 min，5%～15%乙腈;18～32 min，15% ～26%乙腈;32～35 min，26% ～27%乙腈;35～48 min，27%～40%乙腈)，檢測波長230 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，分析時間48 min。結(jié)果:根據(jù)10批樣品建立了天麻首烏片的高效液相色譜指紋圖譜，確定了18個共有峰，其中包含天麻、何首烏等6味藥的特征峰。結(jié)論:該法靈敏度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，且分析速度較快，可用于天麻首烏片的質(zhì)量評價。

天麻首烏片;高效液相色譜法;指紋圖譜

天麻首烏片是由天麻、白芷、何首烏、熟地黃、丹參、川芎、墨旱蓮、女貞子、白芍、黃精、甘草、當(dāng)歸、桑葉、蒺藜(炒)共14味藥組成，具有滋陰補腎、養(yǎng)血息風(fēng)的功能，用于肝腎陰虛所致的頭暈?zāi)垦！㈩^痛耳鳴、口苦咽干、腰膝酸軟、脫發(fā)、白發(fā);血管神經(jīng)性頭痛、脂溢性脫發(fā)見上述證候者，對治療頭痛、頭暈、脫發(fā)、白發(fā)的效果較為明顯。中藥指紋圖譜方法已廣泛用于中藥的質(zhì)量控制，它能更為全面地反映中藥中化學(xué)成分的相對關(guān)系，從而對其進(jìn)行整體描述和評價［1-2］。本試驗中采用 HPLC建立天麻首烏片特征圖譜色譜條件，并通過與藥材的比較對色譜峰進(jìn)行定位歸屬，以期為天麻首烏片的質(zhì)量控制及評價提供一種較全面的分析手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津)，AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，HX-06型超聲清洗器(武漢恒信世紀(jì)科技有限公司)，HH型恒溫水浴鍋(江蘇金壇市中天儀器廠)。

1.2 試藥

對照品二苯乙烯苷(批號110844-201310，按94.9%計)、芍藥苷(批號110736-201337，按94.9%計)、天麻素(批號110807-201507，按95.4%計)、沒食子酸(批號110831-201204，按94.9%計)、甘草苷(批號111610-201106，按93.7%計)均購于中國食品藥品檢定研究院，特女貞苷(批號 MUST-11040402，純度≥98%)購于成都曼斯特生物科技有限公司，甲醇(分析純，湖南匯虹試劑有限公司)，磷酸(分析純，湖南匯虹試劑有限公司)，乙腈(色譜純，ACE)，水為娃哈哈純凈水，天麻、白芷、何首烏、熟地黃、丹參、川芎、墨旱蓮、女貞子、白芍、黃精、甘草、當(dāng)歸、桑葉、蒺藜(炒)均購自于長沙老百姓大藥房，天麻首烏片(批號分別為20151102、20151104、20151106、20151114、20151123、20151205、20151217、20151222、20160110、20160113)由湖南國華制藥股份有限公司提供。

2 方法

2.1 色譜條件

Kromasil C18(250×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相乙腈(A)-0.3%磷酸水溶液(B)梯度洗脫，0～18 min，5% ～15%A，18～32 min，15% ～26%A，32～35 min，26%～27%A，35～48 min，27%～40% A。檢測波長230 nm，流速1.0 mL·min－1，柱溫30℃［3-5］，分析時間48 min。精密吸取上述溶液10 μL注入高效液相色譜儀測定［6］。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取二苯乙烯苷、天麻素、芍藥苷、沒食子酸、甘草苷、特女貞苷對照品適量置于容量瓶，加甲醇溶解制成濃度分別為0.04408、1.000、0.06900、10.40、0.02040、0.4400 mg·mL－1對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品約0.5 g精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，取出放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 藥材溶液制備 稱取天麻、何首烏、川芎對照藥材各0.1 g，分別置于100 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，回流提取30 min濾過，取續(xù)濾液即得。

精密稱取白芷、熟地黃、丹參、墨旱蓮、女貞子、白芍、黃精、甘草、當(dāng)歸、桑葉、蒺藜(炒)對照藥材各5 g，按工藝水煮后定容至100 ml，精密吸取25 ml蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至25 ml，即得。

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)方的色譜指紋圖譜研究

3.1.1 方法學(xué)考察 (1)精密度試驗:取樣品約0.5 g(批號20151102)精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以二苯乙烯苷為參照峰S，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各特征峰相對保留時間RSD小于0.30%，相對峰面積RSD小于6.00%，表明方法精密度良好。

(2)重復(fù)性試驗:取樣品約 0.5 g(批號20151102)精密稱定，平行6份按2.2.2項下方法平行制備6份供試液，在同一色譜條件下進(jìn)樣記錄色譜圖，以二苯乙烯苷為參照峰S，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各特征峰相對保留時間RSD小于0.76%，相對峰面積RSD小于7.50%，表明方法重復(fù)性良好。

(3)穩(wěn)定性試驗:取供試品(批號20151102)溶液于0、1、2.5、5、10、20 h進(jìn)樣分析，以二苯乙烯苷為參照峰S，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各特征峰相對保留時間RSD小于0.30%，相對峰面積RSD小于6.00%，表明方法在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.2 色譜指紋圖譜的測定及相似性分析按2.2.2項下供試品溶液的制備方法處理10批供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄48 min的色譜圖。

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2.0版)》對10批樣品的HPLC圖進(jìn)行多點校正、自動匹配(時間窗寬度為0.10)，用中位數(shù)法生成對照圖譜R(即共有模式圖，見圖1)并計算相似度，結(jié)果顯示10批樣品特征峰的相似度均在0.9以上。

根據(jù)圖1中10批樣品HPLC圖給出的峰數(shù)、峰面積積分值及相對保留時間，選取其中18個共有峰作為特征指紋峰(見圖2)，并選擇14號峰(二苯乙烯苷)作為參比峰(S峰)，計算各色譜峰的保留時間和峰面積比值，得到相對保留時間和相對峰面積平均值(結(jié)果見表1)。

圖1 10批天麻首烏片HPLC特征圖譜注:S1.二苯乙烯苷對照品;S2.甲醇溶劑;S3～S12.10批樣品;R.對照圖譜

3.1.3 色譜峰歸屬分析 取天麻、白芷、何首 烏、熟地黃、丹參、川芎、墨旱蓮、女貞子、白芍、黃精、甘草、當(dāng)歸、桑葉、蒺藜(炒)藥材溶液，按上述色譜條件依次進(jìn)樣、測定，將樣品與各單味藥的HPLC色譜圖進(jìn)行比對(見圖3)辨識與歸屬可知，1、8、12號峰為天麻的特征峰，14號峰為何首烏的特征峰，5、17號峰為丹參的特征峰，6、7、13、15號峰為女貞子的特征峰，10、11號峰為白芍的特征峰，2號峰為炒蒺藜的特征峰。其中1號峰為天麻素，3號峰為沒食子酸，11號峰為芍藥苷，13號峰為甘草苷，14號峰為二苯乙烯苷，15號峰為特女貞苷。

圖2 天麻首烏片HPLC指紋圖譜共有模式

圖3 天麻首烏片與單味藥HPLC特征圖譜的比較注:S1.天麻;S2.白芷;S3.何首烏;S4.熟地黃;S5.丹參;S6.川芎;S7.墨旱蓮;S8.女貞子;S9.白芍; S10.黃精;S11.甘草;S12.當(dāng)歸;S13.桑葉;S14.炒蒺藜;S15.天麻首烏片

表1 HPLC指紋圖譜特征峰相對保留時間、相對峰面積及歸屬

4 討論

4.1 本試驗中考察了多種流動相系統(tǒng)，如甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.5%冰醋酸溶液。結(jié)果表明，以乙腈-0.3%磷酸溶液為流動相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫時各個峰的分離效果較好，且基線相對平穩(wěn)［7-8］。天麻首烏片藥味多、成分復(fù)雜，以某單一成分的最大吸收波長為檢測波長無法體現(xiàn)所有成分的特征，故對220 nm、230 nm、254 nm、280 nm、320 nm波長下的色譜圖進(jìn)行分析［9-11］，結(jié)果顯示220 nm、230 nm波長下色譜峰的個數(shù)最多，而220 nm接近甲醇溶劑的截止波長，故選擇230 nm作為特征圖譜的檢測波長。

4.2 研究過程中，還考察了不同提取溶劑對樣品的提取效果，以乙醇、70%乙醇、甲醇、70%甲醇作為提取溶劑提取樣品。通過色譜圖的比較發(fā)現(xiàn)，各方法對應(yīng)色譜圖中特征峰個數(shù)一致。但以甲醇為提取溶劑的樣品所對應(yīng)的色譜圖峰形較好，故選擇甲醇作為樣品提取溶劑。

4.3 本實驗進(jìn)行了復(fù)方HPLC指紋圖譜研究，標(biāo)定了18個共有峰，對這18個共有峰進(jìn)行了藥味歸屬，初步闡明了共有峰的來源，其中天麻、何首烏、丹參、女貞子、白芍、炒蒺藜6味藥在樣品特征圖譜上可對應(yīng)到其特有的成分信息，通過與對照色譜圖對比的方法，定性了部分色譜峰，另有2個色譜峰未能進(jìn)行歸屬，有待進(jìn)一步的研究。

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Research on chromatographic fingerprints of Tianmashouwu Tablets by HPLC

SUN Wen-qiao1，PENG Yan-mei1，LI Yue-hui，ZHOU Run-wei1，ZHU Li-hua2△

(1.Traditional Chinese medicine research institute of hunnan province，Changsha，410013，China; 2.Hunan guohua pharmaceutical CO.，LTD.，Changsha，410013，China)

Objective To establish the HPLC chromatogram fingerprints of Tianmashouwu Tablets.Methods:The chromatographie fingerprints were obtained through Kromasil C18 column(4.6 mm×250 mm，5 μm)with the gradient elution solvent system composed of acetonitrile-0.2%phosphoric acid(0～18 min，5% ～15%acetonitrile;18～32 min，15%→26%acetonitrile;32～35 min，26% ～27%acetonitrile;35～48 min，27% ～40%acetonitrile).The detective wavelength was set at 230 nm;the flow rate was 1.0 m L/min;the column temperature was maintained at 30℃ and the injection volume was 10 μL;the analysis time was 120 min.Results The HPLC characteristic chromatogram was built on basis of 10 batches of Tianmashouwu Tablets，including 18 common peaks which contain the characteristic peaks of 6 Chinese herbal medicines，such as Gastrodia elata Bl，F(xiàn)allopia multiflora(Thunb.)Harald.，etc.Conclusion:The established HPLC fingerprint has high is a reliable，available and quick method，which can be used in the quality evaluation of Tianmashouwu Tablets.

Tianmashouwu Tablets;HPLC;chromatogram fingerprints

R692.4

B

1006-3250(2016)11-1534-04

2016-04-27

蘇文俏(1991-)，女，在讀碩士，從事中藥學(xué)的臨床與研究。

△通訊作者:朱立華(1964-)，男，副研究員，從事企業(yè)管理與中藥生產(chǎn)研究，Tel:13907312798，E-mail:380565887@qq.com。